作物杂志, 2018, 34(5): 54-62 doi: 10.16035/j.issn.1001-7283.2018.05.009

遗传育种·种质资源·生物技术

山羊草谷胱甘肽S-转移酶基因家族鉴定及表达分析

马建辉, 张文利, 高小龙, 张黛静, 姜丽娜, 翟延玉, 邵云, 李春喜

河南师范大学生命科学学院,453007,河南新乡

Identification and Expression Analysis of the Whole Glutathione S-Transferase Genome Family in Aegilops tauschii under Abiotic Stress

Ma Jianhui, Zhang Wenli, Gao Xiaolong, Zhang Daijing, Jiang Lina, Zhai Yanyu, Shao Yun, Li Chunxi

College of Life Sciences, Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China

通讯作者: 李春喜为通信作者,教授,主要从事小麦栽培生理研究

收稿日期: 2018-03-8   修回日期: 2018-04-20   网络出版日期: 2018-10-15

基金资助: “十三五”国家重点研发计划.  2017YFD0301101
“十三五”国家重点研发计划.  2016YFD0300203-2
“十二五”国家科技支撑计划.  2013BAD07B14

Received: 2018-03-8   Revised: 2018-04-20   Online: 2018-10-15

作者简介 About authors

马建辉,副教授,主要从事小麦抗逆生理研究 。

摘要

谷胱甘肽S-转移酶是一种多功能蛋白酶,在植物体内参与干旱、盐、低温、重金属等多种非生物胁迫的调节;山羊草是普通小麦D染色体组的供体物种,深入挖掘山羊草中GST基因,对进一步分析六倍体小麦GST基因的功能具有重要意义。本研究利用信息生物学手段,在山羊草中共发现114条GST基因序列,分属于6个亚族;基因复制分析发现共4对基因发生了基因复制,且均为纯化选择;采用荧光定量PCR对部分GST基因在非生物胁迫下的表达分析发现,8个GST基因在响应干旱和盐胁迫时,主要在根部显著上调表达,3个GST基因在响应低温胁迫时,在根和叶中均显著上调表达,说明山羊草中的GST基因在应答非生物胁迫时,在不同组织中的表达存在着差异。

关键词: 山羊草 ; 谷胱甘肽S-转移酶 ; 全基因组筛选 ; 非生物胁迫

Abstract

Glutathione S-transferase (GST) is a multifunctional protease which involves in the regulation process of many abiotic stresses (drought, salt, low temperature, heavy metals) in plants. Aegilops tanschii is the donor of D genome for hexaploid wheat (Triticum aestivum, AABBDD), and the study on GST genome family in Aegilops tanschii (DD) will facilitate the further study of GST in hexaploid wheat. In this study, 114 GST genes from Aegilops tanschii were selected and classified into 6 subfamilies. Gene duplication analysis found that four pairs GST genes had been duplicated and they belonged to purify selection. The expression levels of some GST genes under environmental stress found that eight GST genes were highly expressed in root under drought and salt stress by qRT-PCR assay, in which three GST genes were up-regulated significantly responding to low temperature in root and leaf. This suggested there was a difference in the expression of GSTs in Aegilops tauschii responding to abiotic stress in root and leaf.

Keywords: Aegilops tauschii ; Glutathione S-transferase ; Genome-wide screening ; Abiotic stress

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本文引用格式

马建辉, 张文利, 高小龙, 张黛静, 姜丽娜, 翟延玉, 邵云, 李春喜. 山羊草谷胱甘肽S-转移酶基因家族鉴定及表达分析[J]. 作物杂志, 2018, 34(5): 54-62 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2018.05.009

Ma Jianhui, Zhang Wenli, Gao Xiaolong, Zhang Daijing, Jiang Lina, Zhai Yanyu, Shao Yun, Li Chunxi. Identification and Expression Analysis of the Whole Glutathione S-Transferase Genome Family in Aegilops tauschii under Abiotic Stress[J]. Crops, 2018, 34(5): 54-62 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2018.05.009

谷胱甘肽S-转移酶(GST)在植物体内普遍存在,由一个庞大的基因家族编码,是一种重要的多功能蛋白酶[1]。根据氨基酸序列的相似性可以将GST分为7种类型:Phi、Zeta、Tau、Lambda、Theta、DHARs和TCHQD型,其中Phi型基因均包括3个外显子;Zeta型基因均有10个外显子,并与哺乳动物的Zeta GST基因相似;Tau型基因有2个外显子,由植物激素诱导产生[2,3]。近年来人们对GST做了比较广泛的研究,通过对不同物种中GST的研究发现,其在降低异源物质毒性、跨膜运输、保护细胞免受氧化损伤、维持植物新陈代谢以及响应多种非生物胁迫等多个方面都具有重要的作用[4,5]

GST广泛分布于动物、植物、细菌、真菌中[6]。在植物中,可溶性的GST由庞大而多样化的基因家族所编码,例如在拟南芥中发现有48个GST基因,在水稻中多达59个GST基因[7,8,9]。江董丽等[10]在大豆中鉴定出94个GST家族基因,分属于5个亚家族,分别分布在大豆的16条染色体上。随后,李晓玉等[11]对玉米中GST基因家族进行分析,根据GST蛋白序列构建隐马尔可夫模型,鉴定出玉米全基因组中含有37个GST基因,随机分布在10条玉米染色体上。Wu等[12]对水稻的研究发现,对水稻施加除草剂后,其根部的谷胱甘肽S-转移酶活性显著增强,并进一步分离出编码GST的一对基因(RgstI、II)进行荧光定量分析,发现该基因显著上调表达,以RgstI和II的反转录产物为探针进行印迹法分析,结果显示GST基因能增强水稻对除草剂的耐受性。此外,Moons[13]研究Cd、Zn、Co和Ni对水稻的毒害作用发现,水稻根部的osgstu4和osgstu3基因快速显著上调表达,其中osgstu3基因同时被盐和脱落酸(ABA)胁迫诱导快速表达。李永生等[14]在玉米中克隆了逆境响应基因ZmGST23,并表明干旱、水涝、盐、脱落酸、生长素、赤霉素、低温等处理显著诱导该基因的表达,且在幼芽和成熟叶片中表达量较高,存在显著的组织特异性。与之类似,Wang等[15]将从野生大豆基因组中筛选出的GsGST19基因转化到苜蓿中,结果表明转基因苜蓿株系中GST活性显著增强,丙二醛含量和相对质膜透性均低于非转基因株系,而且根系活力较高,该基因的过量表达显著增强了植株的耐盐碱能力。韩少怀等[16]的研究表明,大豆GmGST12基因对缓解ROS对植物的毒害具有重要作用。Rezaei等[17]在大麦中发现84条GST基因,对其进行序列比对和系统发育分析,将其分为8个亚族,干旱处理时大豆的GST基因表达上调,GST酶活性显著增高。

1988年Williamson等[18]在小麦面粉中提取并纯化了GST。1991年,Mauch等[19]从小麦被病原菌诱导表达的基因中分离出了与玉米GST基因序列相似的基因GSTA1,证实GSTA1基因具有GST功能。2013年,吴金华等[20]克隆了与小麦白粉病相关GST基因序列,结果表明该GST基因属于白粉菌诱导型基因,并且可能参与小麦白粉病的响应反应。之后许多研究者相继发现,一些异型生物质(如除草剂)会对小麦等作物产生毒害,而这些异型生物质在小麦植株内的代谢与GST密切相关[21]。近年来小麦基因组测序的逐步完成也为人们深入研究GST提供了一定的基础。

山羊草(Aegilops tanschii)是普通六倍体小麦D组染色体的原始供体,2013年山羊草全基因组测序的完成为六倍体小麦基因组数据的拼接与质量把控提供了重要的参考依据。谷胱甘肽S-转移酶是一种多功能蛋白酶,在植物体内参与干旱、盐、低温、重金属等多种非生物胁迫的调节。目前,未见对山羊草中GST家族的分类及功能研究的相关报道。本研究首次在山羊草全基因组数据库中筛选出GST家族基因,并对其基因结构、进化关系、复制及在非生物胁迫下的表达模式等进行系统分析,为深入挖掘六倍体小麦中的GST基因打下良好基础,并为进一步分析GST基因家族在普通六倍体小麦形成过程中的进化提供重要的参考序列。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

试验于2017年在河南师范大学小麦实验室进行。本试验以山羊草Y2282为材料,选取饱满一致的种子,均匀摆在铺有湿润滤纸的培养皿中,并在智能人工气候箱(温度昼25℃和夜20℃,光照时间16h,相对湿度75%)中培养,当第2片幼叶萌发时,挑选根长株高一致的幼苗进行干旱(15% PEG-6000)、盐(1.0% NaCl)和低温(4℃)胁迫处理,处理时间均为6h;以正常生长的幼苗为对照,每种处理设置3个重复。分别选取各处理植株的根和叶组织,迅速浸没于液氮中,并保存于-80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 山羊草小麦GST基因的筛选 在AGDB网站(ftp://climb.genomics.cn/pub/10.5524/100001_101000/100050/A/)下载山羊草全基因组和蛋白组数据,在TAIR网站中(http://www.arabidopsis.org/)下载拟南芥GST家族基因的蛋白序列(PEP)和编码区序列(CDS)数据[22]。以拟南芥GST家族基因的编码区序列和蛋白序列对山羊草的基因组和蛋白组数据分别进行Blastn和Blastp本地比对,并进一步利用Editplus 3软件调取E-value值小于10-5的相似序列。利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)和SMART网站(http://smart.embl.de/),对上述所得基因的蛋白序列进行分析,然后去除无典型的或不完整的GST结构域序列[23,24],从而获得山羊草全长的GST基因。利用ExPASy-ProtParam tool在线分析工具(http://web.expasy.org/protparam/)对所得GST基因编码蛋白的氨基酸残基长度(aa)、分子量(Da)、等电点(pI)等基本特征进行分析。

1.2.2 GST基因进化树分析 利用ClustalW软件对山羊草和拟南芥的GST基因的保守结构域序列进行多重比对分析,然后使用MEGA 5.10中的邻比法(Neighbor-Joining,NJ)构建进化树,并分析山羊草GST基因的类型及功能。

1.2.3 GST基因复制分析 为了探究GST基因在山羊草中的变异情况,对所得基因进行复制分析,选择114个GST基因蛋白序列进行本地序列比对分析,筛选条件如下:(1)基因序列覆盖度及两者相似度超过70%;(2)与其他基因只发生1次基因复制。通过PAL2NAL获取同义突变频率(Synonymous,Ks)和非同义突变频率(Nonsynonymous,Ka)[25],并计算Ka/Ks值,判断基因复制进化的选择类型。最后,根据禾本科植物所采用的r=6.5×10-9计算复制年限,其公式为:T=Ks/2r[26]

1.2.4 荧光定量分析 使用Trizol法提取山羊草根、叶的总RNA,使用gDNA buffer(TaKaRa,大连)42℃处理3min去除残余DNA,最后使用PrimeScript RT reagent Kit 试剂盒(天根生化,北京)将RNA反转录为cDNA。

应用Primer 5和Oligo 6软件,在部分GST基因的非保守序列区域设计引物(表1)。以上述cDNA为模板,应用所设计的荧光定量引物进行PCR扩增并对扩增产物进行测序分析,PCR产物条带单一且测序结果与目的片段相同时,则表明引物特异性较好,可用于后续的荧光定量分析。根据ChamQTM SYBR qPCR Master Mix试剂盒(Vazyme,南京)提供的反应条件进行荧光定量分析(每个样品设3个重复),反应体系为20μL,包括2×SYBR qPCR Master Mix 10μL,正、反引物各0.4μL,1μL cDNA模板,无菌水8.2μL。扩增程序为95℃预变性30s;95℃变性10s,58℃退火15s,共设43个循环,以Actin为内参,使用2-ΔΔCT法对基因的相对表达量进行分析。

表1   荧光定量引物及序列

Table 1  The primer and sequences for qRT-PCR

基因Gene上游引物(5′-3′) Forward primer下游引物(5′-3′) Reverse primer
AEGTA43277GACGAGGTCTGGGCTTATGCTTGTCATCAATGTAGGCG
AEGTA19581GCGATGAAGCCCGTCCTGTTTCCACTCCACCGCCCTGT
AEGTA31937ACACCGACGAGTCCAATAGGAAGAAAGGTCCATCAC
AEGTA27563CGACCTCACCCATTTCTCCTCCCACCATGCCTTTACG
AEGTA27835GGACCTTGGGCTTGGACTACTCTGCTTTCTTTCGG
AEGTA15985TCCGTGTCGTGTCTGCGCTCCCTCTCACACACCCACA
AEGTA32578ACACCGAATCCTGAAACCCTCATCACCAACAACCTCC
AEGTA07316GCCTACTATGCCGCCAAGAGAAGCGACTTGCCTCTGAC
ActinACCTTCAGTTGCCCAGCAATCAGAGTCAAGCACAATACCAGTTG

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1.2.5 数据分析 使用Excel 2010及SPSS 22.0软件进行数据统计分析。采用邓肯法(Duncan)进行差异显著性检验,不同小写字母表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。

2 结果与分析

2.1 山羊草中GST基因的基本信息

从TAIR网站下载拟南芥GST基因的序列和蛋白序列,分别与山羊草数据库进行本地Blastp和Blastn分析,设置E-value<10-5,初步筛选出148个GST相似序列的基因。调取各候选GST基因的全长蛋白序列,进行Pfam结构域分析,发现不含完全开放读码框的基因序列有16条;之后进行SMART结构域分析,发现不含或含有不完整GST结构域的基因序列有11条,然后手动去除7条非全长序列,最终在山羊草中得到了114个具有全长序列的GST基因,其中58个GST基因仅含有GST-N结构域,11个GST基因仅含有GST-C结构域,同时含有GST-N结构域和GST-C结构域的GST基因有45个(表2)。山羊草GST家族114个基因编码蛋白的氨基酸长度范围为76~748aa,跨度比较大;等电点pI范围为4.61~9.69,其中85.3% GST基因的等电点小于7,而大于9.0的GST基因占到6.03%;分子量范围为8 269.73~84 666.01 Da。

表2   山羊草GST基因序列的基本信息

Table 2  Details of GST genes in Aegilops tauschii

基因
Gene
CDS 长度
CDS length (bp)
等电点
pI
相对分子质量
Mw (Da)
结构域
Domain
基因
Gene
CDS 长度
CDS length (bp)
等电点
pI
相对分子质量
Mw (Da)
结构域
Domain
AEGTA136573905.7914 719.93GST-CAEGTA259633725.0513 533.33GST-N
AEGTA137966098.3222 678.94GST-CAEGTA256386575.5224 109.04GST-N
AEGTA1773621966.0380 584.69GST-CAEGTA255544445.5916 200.62GST-N
AEGTA426209609.4935 732.50GST-CAEGTA254086095.7021 048.37GST-N
AEGTA323226725.9825 554.08GST-CAEGTA234903849.1013 884.20GST-N
AEGTA319361 2038.2645 449.39GST-CAEGTA215077055.4825 157.07GST-N
AEGTA293702 2477.2184 666.01GST-CAEGTA208666905.4625 911.98GST-N
AEGTA290026425.7324 116.71GST-CAEGTA205455019.6919 060.96GST-N
AEGTA278133788.6014 194.45GST-CAEGTA196796934.9524 756.53GST-N
AEGTA267756395.5823 948.80GST-CAEGTA195816425.5423 959.65GST-N
AEGTA260867415.8026 559.98GST-CAEGTA182937418.3227 648.02GST-N
AEGTA045588136.3629 861.92GST-NAEGTA180744775.7817 388.99GST-N
AEGTA050637025.2025 652.54GST-NAEGTA017851 8156.2867 887.41GST-N,GST-C
AEGTA050657085.0225 716.41GST-NAEGTA061866635.4425 070.80GST-N,GST-C
AEGTA061727595.4028 974.13GST-NAEGTA067178045.3431 072.37GST-N,GST-C
AEGTA073166544.6123 214.00GST-NAEGTA073176935.8625 879.92GST-N,GST-C
基因
Gene
CDS 长度
CDS length (bp)
等电点
pI
相对分子质量
Mw (Da)
结构域
Domain
基因
Gene
CDS 长度
CDS length (bp)
等电点
pI
相对分子质量
Mw (Da)
结构域
Domain
AEGTA097227055.3025 149.91GST-NAEGTA087797118.0926 568.83GST-N,GST-C
AEGTA099736815.7125 328.09GST-NAEGTA088306515.9024 455.20GST-N,GST-C
AEGTA101107655.3328 262.30GST-NAEGTA092306665.3124 986.57GST-N,GST-C
AEGTA101387085.5325 204.16GST-NAEGTA097626726.2525 398.78GST-N,GST-C
AEGTA104116275.4022 926.60GST-NAEGTA098175466.0520 564.77GST-N,GST-C
AEGTA116037475.1627 138.48GST-NAEGTA104386695.4123 999.86GST-N,GST-C
AEGTA116041 0926.3239 789.49GST-NAEGTA114947657.6528 670.37GST-N,GST-C
AEGTA144286339.5922 899.47GST-NAEGTA124479099.0833 467.91GST-N,GST-C
AEGTA156716995.6625 728.59GST-NAEGTA128996905.2825 830.90GST-N,GST-C
AEGTA163496275.6223 165.92GST-NAEGTA137996485.3824 132.08GST-N,GST-C
AEGTA164777085.0725 769.76GST-NAEGTA140556485.0424 629.13GST-N,GST-C
AEGTA173965015.4018 216.14GST-NAEGTA164426035.9922 114.72GST-N,GST-C
AEGTA198827235.6626 175.10GST-NAEGTA175337294.7426 596.62GST-N,GST-C
AEGTA437707145.0924 973.69GST-NAEGTA175356634.9624 132.84GST-N,GST-C
AEGTA430577115.3026 382.24GST-NAEGTA159851 0338.3737 089.78GST-N,GST-C
AEGTA428607115.7426 027.62GST-NAEGTA432777056.4525 623.80GST-N,GST-C
AEGTA331693456.4012 739.92GST-NAEGTA325606545.6124 039.74GST-N,GST-C
AEGTA329077025.2225 195.97GST-NAEGTA323236815.9824 942.60GST-N,GST-C
AEGTA325787299.0527 186.61GST-NAEGTA322721 2426.1846 835.95GST-N,GST-C
AEGTA325616755.9624 978.81GST-NAEGTA319378375.3831 118.60GST-N,GST-C
AEGTA321637145.9125 910.74GST-NAEGTA318876995.9126 142.34GST-N,GST-C
AEGTA319816665.4124 879.73GST-NAEGTA309497896.1429 087.61GST-N,GST-C
AEGTA317686215.3622 760.86GST-NAEGTA309186425.7823 465.08GST-N,GST-C
AEGTA316917085.4525 312.46GST-NAEGTA303536935.5924 828.77GST-N,GST-C
AEGTA314777085.8825 038.75GST-NAEGTA303526935.2524 817.67GST-N,GST-C
AEGTA311241 0625.8838 993.78GST-NAEGTA301656966.0025 764.75GST-N,GST-C
AEGTA308846995.2325 566.66GST-NAEGTA288576756.3925 447.57GST-N,GST-C
AEGTA305417204.9325 819.79GST-NAEGTA283636965.5325 699.85GST-N,GST-C
AEGTA302526696.3425 011.77GST-NAEGTA278356695.3024 444.14GST-N,GST-C
AEGTA294916125.2823 444.87GST-NAEGTA275686515.3724 521.99GST-N,GST-C
AEGTA290007027.6725 567.69GST-NAEGTA275636696.1724 687.63GST-N,GST-C
AEGTA289176935.9025 284.30GST-NAEGTA270207266.7126 315.23GST-N,GST-C
AEGTA285027265.3225 719.43GST-NAEGTA269177626.4628 859.70GST-N,GST-C
AEGTA284737989.2231 126.08GST-NAEGTA268966755.3124 979.85GST-N,GST-C
AEGTA273746635.0025 687.24GST-NAEGTA268757325.0126 411.51GST-N,GST-C
AEGTA270018348.5430 651.56GST-NAEGTA260546605.9925 001.99GST-N,GST-C
AEGTA269967115.1625 507.27GST-NAEGTA254466785.2225 907.45GST-N,GST-C
AEGTA269957086.1326 018.01GST-NAEGTA211798345.6930 222.34GST-N,GST-C
AEGTA269947115.5725 309.11GST-NAEGTA201486575.4524 738.36GST-N,GST-C
AEGTA260807865.5729 366.79GST-NAEGTA189876905.5125 070.84GST-N,GST-C
AEGTA259647145.6826 104.21GST-NAEGTA183547025.4026 076.15GST-N,GST-C

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2.2 GST基因系统进化关系

为了进一步分析GST基因在山羊草中的进化以及分子功能,本研究采用邻比法(Neighbor-Joining,NJ)构建GST基因的系统进化树。114条含有GST结构域的山羊草蛋白序列与已知的拟南芥GST蛋白序列进行多重序列联配(ClustalW软件),然后应用MEGA 5.10构建进化树,进行系统进化分析(图1)。114个GST基因被分为GroupⅠ和GroupⅡ两大族,共包含6个亚族Tau、Phi、Lambda、Zeta、Theta和CHQD,其中Tau亚族是山羊草中最大的GST家族,包含了70个GST基因,其次是Phi亚族,包含31个GST基因,其余各亚族GST基因在山羊草中所占的比例与拟南芥相似。

图1

图1   山羊草GST基因的系统进化树

Fig.1   Phylogenetic tree of GST genes


通过查找拟南芥GST基因的功能,发现AtGSTU13、AtGSTU14、AtGSTU15、AtGSTU27、AtGSTU28以及AtGSTF13参与植物有毒物质的代谢过程,此外Tau家族中的AtGSTU28、AtGSTU27基因还参与镉离子胁迫反应;Phi家族中的AtGSTF2基因与植物抗寒、耐盐等非生物胁迫应答有关。根据多重序列比对以及进化树亲缘关系分析,推断山羊草GST基因AEGTA29491、AEGTA31981、AEGTA06717、AEGTA27374、AEGTA25446可能与山羊草有毒物质的代谢密切相关;AEGTA06172、AEGTA25446、AEGTA27374、AEGTA06717可能涉及镉离子胁迫反应过程;AEGTA18987、AEGTA30918可能与植物抗冻以及耐盐等非生物胁迫有关。

2.3 GST基因的复制分析

为了进一步探究GST的进化和变异情况,将所得的GST核酸序列进行多重比较,结果发现共4对基因(AEGTA30352与AEGTA30353;AEGTA20866与AEGTA28917;AEGTA28363与AEGTA31887;AEGTA26896与AEGTA27835)发生了基因复制。通过Ka/Ks的分析发现[27],4对基因的Ka/Ks值均远小于1,分别为0.1746、0.3077、0.2525和0.4524,这表明4对基因在复制过程中均发生了纯化选择,从而使群体中的有害变异得到净化(表3)。进一步对4对基因的复制年限进行分析,发现AEGTA30352与AEGTA30353大约在95百万年前(million years ago,Mya)发生了基因复制;AEGTA20866与AEGTA28917大约在50Mya发生了基因复制;AEGTA28363与AEGTA31887大约在32Mya发生了基因复制;AEGTA26896与AEGTA27835大约在20Mya发生了基因复制。

表3   山羊草GST基因复制分析

Table 3  Duplication analysis of GST genes

基因Gene同义突变频率Ks非同义突变频率KaKa/Ks纯化选择Purify selection复制时间(Mya)
AEGTA30352-303530.12430.02170.174695
AEGTA28363-318870.41790.10550.252532
AEGTA20866-289170.65750.20230.307750
AEGTA26896-278350.26280.11890.452420

** are representative of significantly difference at 0.01 level in roots and leaves with the same treatment, the different small letters indicate the expression levels of GSTs are signifficantly difference between different treatments (P<0.05)

**表示相同处理条件下,基因在根和叶中的表达情况存在极显著差异(P<0.01);不同小写字母表示不同处理基因表达差异达到显著水平(P<0.05)

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2.4 GST基因在非生物胁迫下的表达分析

为了探究山羊草GST基因在非生物胁迫下的表达模式,本试验随机选择了8个GST基因,分析它们在不同非生物胁迫(干旱、盐、低温)处理的山羊草幼苗根和叶中的表达模式。结果(图2)表明,在盐胁迫下,AEGTA43277、AEGTA19581、AEGTA31937、AEGTA27563、AEGTA27835在山羊草的根中显著上调表达,其中AEGTA31937在叶中同样显著上调表达,其余各基因在叶中呈现下调表达的趋势;干旱处理,随机选取的8个基因在根中均显著上调表达,表明GST基因可能在干旱胁迫条件下发挥着重要作用,同样的,GST基因在叶中表达不显著,这似乎表明GST基因在响应盐和干旱胁迫时,主要在根中发挥作用;在低温胁迫下,AEGTA19581、AEGTA27563、AEGTA27835、AEGTA32578和AEGTA07316在山羊草的根中显著上调表达,而AEGTA31937、AEGTA27563、AEGTA32578和AEGTA07316在叶中也显著上调表达,这表明GST基因在响应低温胁迫时,可能同时在根和叶中发挥着调控作用。通过以上结果可以看出山羊草的GST基因在应答非生物胁迫中均发挥着重要作用。

图2

图2   GST基因在非生物胁迫下的荧光定量表达分析

Fig.2   The expression pattern analysis of GST genes under abiotic stress


3 讨论

GST基因是一个庞大而多样的基因家族,在植物应答非生物胁迫中发挥着重要作用,比如,增强植物对低温、干旱、盐碱、重金属等非生物胁迫的耐受能力[28]。本研究首次对山羊草GST基因家族进行分析,通过全基因组信息学分析,共筛选出114条GST家族基因,分属于6个亚族,其中Tau亚族和Phi亚族包含的GST基因数量最多,分别为70个和31个,而Theta亚族最少,只有1个基因。根据已知的报道[29],拟南芥中GST基因家族中,最大的亚族是Tau亚族,包含28个GST基因,其次为Phi亚族,包含13个GST基因,最少的是Zeta和Lambda亚族,分别包含2个GST基因。山羊草中GST基因数目是拟南芥中GST基因数目的2.4倍,但GST基因在各亚族的分布与拟南芥相似。江董丽等[10]对大豆中GST基因的研究表明,大豆基因家族数目接近拟南芥的2倍,且GST基因在各亚族的分布情况也与拟南芥相似。本研究构建了GST基因的系统进化树,根据拟南芥GST基因的功能,推断获得的GST基因可能与植物响应低温、镉离子毒害、盐和干旱等非生物胁迫相关,参与植物有毒物质的代谢过程。

胁迫因子如干旱、盐、冷害、重金属等严重影响了植株的正常生长,GST基因在响应植株非生物胁迫方面发挥着重要作用[30]。戚元成等[31]的研究发现,过量表达GST基因能加速盐胁迫下拟南芥的生长。Liu等[32]在烟草中过表达PpGST基因,发现转基因烟草的GST活性比野生型增加19%,并增强了转基因植株的抗旱性。类似的,对番茄、大豆、牧豆树等GST基因的研究均发现该基因增加了植株的抗旱性[33,34,35],研究者分别在核桃、山茶花、水稻等中发现GST基因能够增强植株抗冷冻胁迫[36,37,38]。为了进一步验证GST基因在山羊草中的功能以及在非生物胁迫下的表达模式,随机选择了8个GST基因,应用荧光定量方法分析它们在非生物胁迫(干旱、盐和低温)下山羊草幼苗根、叶中的相对表达量。结果表明在响应干旱和盐胁迫时,根中的GST基因显著上调表达;在响应低温胁迫时,山羊草根和叶中的GST基因均上调表达,总之,选取的8个GST基因均在不同程度上响应了非生物胁迫,但不同的GST基因在应答非生物胁迫时的具体表达模式有待进一步探究。

山羊草是普通六倍体小麦的D染色体组供体,深入挖掘山羊草中GST基因的基本特征、进化关系、基因复制以及在非生物胁迫下的表达模式,为进一步研究普通小麦的抗逆性打下基础。

The authors have declared that no competing interests exist.
作者已声明无竞争性利益关系。

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