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作物杂志, 2019, 35(2): 84-89 doi: 10.16035/j.issn.1001-7283.2019.02.012

遗传育种·种质资源·生物技术

基于不同烟草类型基因组重测序的烟草SSR标记的开发和应用

耿歆淇1, 杨惠娟1, 秦艳青2, 杨兴有2, 赵世民3, 史宏志1

1 河南农业大学烟草学院/国家烟草栽培生理生化基地,450002,河南郑州

2 四川省烟草公司,610000,四川成都

3 河南省烟草公司洛阳市公司,471026,河南洛阳

Development and Application of Tobacco SSR Markers Based on Genome Re-Sequencing of Different Tobacco Types

Geng Xinqi1, Yang Huijuan1, Qin Yanqing2, Yang Xingyou2, Zhao Shimin3, Shi Hongzhi1

1 Tobacco College/National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;

2 Sichuan Provincial Tobacco Company, Chengdu 610000, Sichuan, China

3 Luoyang Branch, Henan Provincial Tobacco Company, Luoyang 471026, Henan, China

通讯作者: 史宏志,教授,主要从事烟草栽培生理研究

第一联系人:

耿歆淇,硕士研究生,主要从事烟草生物技术研究

收稿日期: 2018-09-29   修回日期: 2018-12-18   网络出版日期: 2019-04-15

基金资助: 降低雪茄烟叶TSNAs关键技术研究及应用.  SCYC201915
烤烟新品系LY1306配套栽培技术研究及应用.  LYKJ201507

Received: 2018-09-29   Revised: 2018-12-18   Online: 2019-04-15

摘要

基于基因组重测序的分子标记研究是一种新的方法。本研究在普通烟草基因组序列已完全测定的基础上重测序了4个烟草品种（系）,包括烤烟类型（LY1306,秦烟96）2个,晒烟类型（Wanmao 3）1个,马里兰烟草类型（Wufeng 1）1个。结合在NCBI中测序并发布的K326和TN90品种的基因组序列,分析了这4个重测序的烟草品种的InDel突变和SNP突变位点,鉴定出7个具有品种多态性的SSR候选位点,其中5个SSR位点可扩增出DNA片段。通过对包括不同烟草类型在内的10个烟草品种进行PCR检测,表明本研究选出的SSR位点可用于烟草品种或烟草类型的分类,其中NW-015889872.1、NW-015854676.1和NW-015890969.1等3个SSR位点可有效区分烤烟、白肋烟和马里兰烟以及晒烟烟草类型。

关键词： 烟草 ; 重测序 ; 基因组 ; SSR标记

Abstract

The development of molecular markers based on genome re-sequencing is a new method and trend. In this research four tobacco varieties (lines) including two flue-cured tobacco types (LY1306 line, Qinyan 96), one sun-cured tobacco type (Wanmao 3) as well as one Maryland tobacco type (Wufeng 1) were re-sequenced on genomic nucleotide sequences. Combined with the genomic sequence of variety K326, TN90 which have been sequenced and released in NCBI, the InDel sites and SNP sites of these four re-sequenced tobacco varieties (lines) were analyzed. Seven SSR (simple sequence repeats) candidate alleles were identified from the genomic analysis which were supposed to be polymorphism among these varieties (lines). Five of them were confirmed to be applicable after amplifying the fragments from the SSR allele sites, respectively. Verification PCR tests were carried on ten tobacco varieties (lines) including different tobacco types revealed that they could be used to classify the tobacco varieties (lines) or tobacco types. Three of the SSR sites including NW-015889872.1, NW-015854676.1 and NW-015890969.1 were indicated that to be very effective on classification of the tobacco types among flue-cured tobacco, burley tobacco and Maryland tobacco as well as sun-cured tobacco.

Keywords： Tobacco ; Re-sequencing ; Genome ; SSR markers

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本文引用格式

耿歆淇, 杨惠娟, 秦艳青, 杨兴有, 赵世民, 史宏志. 基于不同烟草类型基因组重测序的烟草SSR标记的开发和应用[J]. 作物杂志, 2019, 35(2): 84-89 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2019.02.012

Geng Xinqi, Yang Huijuan, Qin Yanqing, Yang Xingyou, Zhao Shimin, Shi Hongzhi. Development and Application of Tobacco SSR Markers Based on Genome Re-Sequencing of Different Tobacco Types[J]. Crops, 2019, 35(2): 84-89 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2019.02.012

重测序[1]是指对已知基因组的品种进行个体间的基因组测序,以此来探究不同样本间个体以及群体的差异性。因为其快速简便,检测结果全面且真实可靠,重测序受到了广泛关注。

简单重复序列（simple sequence repeats,SSR）[2,3]又被称作微卫星,是广泛存在于基因组中的1~6个核苷酸串联重复单元,主要包括基因组SSR和表达序列标签SSR。表达序列标签来源于基因的转录区,直接反映基因的表达信息。SSR在真核生物的基因组序列中普遍存在且随机分布。与其他标记相比,SSR标记具有多态性高、重复性好、共显性、易检测、操作简单、无放射、用时短、覆盖面广等优点。利用SSR标记技术建立植物的指纹图谱[4],可以快速且准确鉴定种质资源及品种的纯度。杨育峰等[5]利用甘薯的转录组数据进行SSR标记的开发,对甘薯种质资源进行了多样性分析,构建遗传连锁图谱、分子标记育种和基因挖掘。聂琼等[6]利用烟草同科植物的SSR引物对烟草差异及亲缘关系进行了有效的鉴定分析。陈云等[7]利用SSR分子标记筛选出的6对反应稳定、多态性好的引物将7个烟草品种区分开,并应用于构建马里兰烟的遗传图谱,同时利用其聚类分析结果对烟草类型进行了划分。

基于基因组重测序技术开发遗传分子标记是一种新的方法,尤其对新出现的表现优良的品系进行重测序更加有助于分子育种的发展,有助于优良性状的培育。2014年普通烟草烤烟品种K326、白肋烟品种TN90以及香料烟品种Basma Xanthi的基因组测序工作已经完成[8]。

按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法分类,我国将栽培烟草划分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟等6大类。本研究对不同烟草类型共4个烟草品种（系）进行基因组重测序,包括烤烟品系LY1306及烤烟品种秦烟96,晒烟品种为Wanmao 3（WM3H）以及马里兰烟品种为Wufeng 1（WF1H）,并结合在NCBI中已发布的烤烟品种K326、白肋烟品种TN90的基因组序列,分析不同烟草类型间以及品种间的InDel突变和SNP突变位点差异,在对数据进行遗传进化分析的基础上筛选准确的遗传标记。

1 材料与方法

1.1 试验样本的采集与DNA测序

试验于2017年在河南农业大学工程楼1413室进行。用于基因组重测序的材料有：烤烟品系LY1306、秦烟96（QY96）和马里兰烟Wufeng 1（WF1H）、晒烟品种Wanmao 3（WM3H）,用于试验验证的材料有：烤烟K326与NC89、中烟100、白肋烟TN90与TN86、雪茄烟Cigar 1,均按照常规漂浮育苗法培育幼苗,叶片长至5~6cm时采集烟草叶片样本,液氮速冻,并放-80℃冰箱保存,用于DNA的提取。

参照商业化Qiagen试剂盒DNeasy Plant Mini Kit提取样本的基因组DNA,电泳检测合格（指有清晰条带）后放入-20℃冰箱保存用于建库。电泳检测合格的DNA样本先经过Covaris随机打断成350bp的片段,采用TruSeq DNA LT Sample Prep Kit试剂盒进行建库,DNA片段经过末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤,最终完成文库构建。利用PE150测序策略以及Illumina X10平台进行双端测序。为消除测序错误对结果的影响,需要对原始测序数据进行质量控制获取Clean Reads,预处理软件为NGSQC toolkit[9]。数据过滤后将Clean Reads与参考基因组比对,根据比对结果分析SNP和InDel位点差异。

1.2 样本SNP及InDel差异分析

以NCBI网站公布的TN90基因组序列为参考基因组,比较LY1306、QY96、WF1H、 WM3H等4个样本,以及其余2个NCBI上已有参考基因组序列的香料烟品种Basma Xanthi（Basma NCBI）、烤烟品种K326（K326 NCBI）之间的SNP及InDeL差异。

2 结果与分析

2.1 测序数据质量控制及试验样本与参考基因组序列比对

使用软件NGSQC toolkit[9]对原始测序数据进行质量控制,过滤掉高质量值碱基（Q20）占比低于70%的数据,获取有效数据（表1）。

表1   基因组测定序列的质量控制结果

Table 1  Sample quality control of genome sequences

样本
Sample		原始数据
Raw Reads data		有效数据(×108)
Clean Reads data		有效数据比例(%)
Clean Reads percent		原始碱基量
Raw bases data		有效碱基量
Clean bases data		有效碱基量比例(%)
Clean base data percent		G和C占比(%)
G and C percent
LY1306974 594 4708.8791.01146189170500
(146.189G)		132816177340
(132.816G)		90.8538
QY96985 001 0649.0491.79147750159600
(147.75G)		135428779630
(135.428G)		91.6638
WF1H993 136 6909.1391.95148970503500
(148.97G)		136798225077
(136.798G)		91.8238
M3H990 035 2769.1792.67148505291400
(148.505G)		137424500354
(137.424G)		92.5338

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由表1结果可知,4个样本重测序的基因组数据质量控制后的序列有效数据量（Clean Reads data）及有效碱基量（Clean bases data）均达到90%以上,符合测序的质量标准。

以NCBI网站白肋烟TN90基因组为参考基因组,利用BWA[10]软件将每个重测序样本（QY96、WM3H、LY1306、WF1H）的Clean Reads比对到参考基因组上,比对结果经过SAMTOOLS[11]软件转换格式后,利用Picard软件去除重复。得到基因组的匹配率（Mapping rate）及覆盖率（Coverage）。

表2中质量控制后样品与参考基因组匹配结果表明,各样本参考基因组的匹配率均在99%以上,说明本试验样本经过质量控制后匹配率高,符合质量控制标准。

表2   样本与参考基因组的质量控制匹配结果

Table 2  Sample and reference genome quality control match result

样本
Sample		有效数据
Clean Reads data		PCR重复比例(%)
PCR duplicate rate		去除PCR重复后数据(×108)
Data after PCR duplication were removed		对比参考基因组的数据(×108)
Compare reference genome data		参考基因组匹配率(%)
Reference genome mapping rate
QY96904 164 14616.187.587.5699.74
WM3H917 495 83215.537.757.7499.91
LY1306887 012 96414.647.577.5799.91
WF1H913 227 01015.977.677.6699.88

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2.2 试验样本SNP、InDeL检测结果及分析

2.2.1 样本SNP检测结果 以TN90为参照,对比表3中各样本不同位置的突变量,位于基因组区间WF1H突变最少,QY96突变最多,位于非翻译区WF1H突变最少,QY96突变最多,从突变总量来看WF1H最少,QY96最多。通过SNP检测对比发现,样本突变量与其本身有关,QY96不同位点的突变最多,而WF1H不同位点的突变数最少。

表3   各测序品种SNP检测结果

Table 3  Sequencing species SNP variant results

样本SampleWF1HWM3HLY1306QY96K326BX
位于基因组上游的突变数The number of mutations in the upstream region297 482355 710352 194583 404542 089364 475
位于基因组下游的突变数The number of mutations in the downstream region104 695123 307123 562200 044187 112126 102
位于基因组区间的突变数The number of mutations in the intergenic region3 152 0303 528 3473 463 4615 285 1514 736 9833 386 957
位于5′端非翻译区域的突变数The number of mutations in the 5′ UTR region6 9169 0098 86712 12710 3578 526
位于3′端非翻译区域的突变数The number of mutations in the 3′ UTR region9 32312 47412 39617 04114 32711 539
位于剪切区域的突变数The number of mutations in the splice region4 3775 2855 3346 3935 5475 146
位于内含子区域的突变数The number of mutations in the intron region111 300132 075133 106191 130172 108134 178
位于外显子区域的突变数The number of mutations in the exon region79 19994 32595 240113 782100 51195 749
总突变数The total mutations3 765 3224 260 5324 194 1606 409 0725 769 0344 132 672

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2.2.2 样本InDeL检测结果 以TN90为参照对比表4中各样本的InDeL突变位点,位于基因组区间WF1H的突变最少,为179 646,K326的突变最多;位于非翻译区的突变WF1H最少,K326最多;从总突变来看,WF1H总突变最小,K326的总突变最多。通过InDeL检测发现,突变数量与样本本身有关,K326不同位点的突变数都为最多,而WF1H不同位点的突变数都是最少。

表4   各测序品种InDeL检测结果

Table 4  Sequencing species InDeL variant results

样本SampleWF1HWM3HLY1306QY96K326BX
位于基因组上游的突变数The number of mutations in the upstream region32 01644 90241 37850 94085 77569 880
位于基因组下游的突变数The number of mutations in the downstream region9 83613 43812 43215 35225 87320 177
位于基因组区间的突变数The number of mutations in the intergenic region179 646226 119212 089250 865437 125295 984
位于5′端非翻译区域的突变数The number of mutations in the 5′ UTR region1 3342 0291 8542 2993 4883 456
位于3′端非翻译区域的突变数The number of mutations in the 3′ UTR region1 1041 6041 4051 9982 9682 241
位于剪切区域的突变数The number of mutations in the splice region6628127498741 081931
位于内含子区域的突变数The number of mutations in the intron region12 61416 88015 44819 79632 14624 199
位于外显子区域的突变数The number of mutations in the exon region2 0592 6412 4503 0454 7063 468
总突变数The total mutations239 271308 425287 805345 169593 162420 336

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常染色体以50kb划窗,统计窗口内的SNP和InDeL数量,绘制circos图（图1）。统计最长的30条scaffold上的SNP和InDeL数量。

图1

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图1   全基因组SNP和InDeL突变位点分布情况

Fig.1   The distribution of mutation sites of SNP and InDeL in the whole genome


通过对不同样本基因组序列差异分析,比较样本间的SNP位点以及InDeL差异基因组序列,4个样本（LY1306、QY96、WM3H、WF1H）的基因组序列差异较大,烤烟与晒烟明显区分,马里兰烟和晒烟亲缘关系较近,同时,LY1306与QY96同为烤烟类型,LY1306与K326亲缘关系较近（图2）。

图2

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图2   测序样本系统进化分析结果

Fig.2   Phylogenetic map of the sequenced samples


2.3 SSR多态性位点分析

通过对该遗传标记进行试验验证研究,重测序后4个烟草样本（LY1306、QY96、WM3H、WF1H）结合NCBI已有的2个烟草品种（K326、TN90）分析重测序品种（系）的SSR位点,得出7个较为稳定的SSR多态性位点（表5）,通过PCR扩增,结果表明,其中5个SSR位点可以扩增出有效片段,是有效的。

表5   基于基因组序列分析SSR多态性位点

Table 5  SSR polymorphism based on genomic sequence analysis

突变位点所在染色体编号
The chromosome number
of the mutation site		突变位点所在染色体上位置
The position of mutation
site on the chromosome		突变位点左端染色体编号
The left end chromosome
number of the mutation site		突变位点右端染色体编号
The right end chromosome
number of the mutation site
NW015795276.114233>NW015795276.1:14032-14232>NW015795276.1:14233-14433
NW015854676.134338>NW015854676.1:34137-34337>NW015854676.1:34338-34538
NW015889872.110709>NW015889872.1:10508-10708>NW015889872.1:10709-10909
NW015890969.17031>NW015890969.1:6830-7030>NW015890969.1:7031-7231
NW015894675.17242>NW015894675.1:7041-7241>NW015894675.1:7242-7442
NW015920095.17693>NW015920095.1:7492-7692>NW015920095.1:7693-7893
NW015930318.114777>NW015930318.1:14576-14776>NW015930318.1:14777-14977

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将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（Marker：DL2000）,结果如图3。

图3

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图3   PCR预试验电泳

Fig.3   PCR pre-test electrophoresis


由图3可知,NW-015894675.1和NW-015920095.1预试验PCR未成功,以此得出5个SSR遗传标记位点（表6）。

表6   用于检测不同烟草类型的SSR多态性位点的引物

Table 6  SSR polymorphic site primers used to distinguish different types of tobacco

编号No.序列名称Seq. name正向引物Forward primer (5′→3′)反向引物Reverse primer (5′→3′)
1NW015795276.1AAAGTGCGTGGAAAAAATCAGCAGCAGAAGAAAAAGTG
2NW015854676.1ATCAAATCCATGCTCCCAAGACCCCAAGATACCCCAAC
3NW015889872.1CAAAAGCAGCAAAAACACAGAGAAATGAACGGAAAGTC
4NW015890969.1CTTAACCACAAAACCCACATTCGTAACAATTATCACCG
5NW015930318.1GTGTTCCTCTGACTTCTCTCCTTAATCTCAAATCTCTC

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2.4 运用SSR多态性位点检测烟草样本

运用SSR标记对10个烟草样本其中包含了4种烟草类型进行多态性位点检测区分（表7）。

表7   SSR多态性位点对不同烟草类型检测结果

Table 7  SSR polymorphism loci analysis results between different tobacco types

烟草类型
Tobacco type		品种(系)
Variety
(Line)		NW-015795276.1
(205-A 208-B 214-C 220-D)		NW-015854676.1
(114-A 115-B 116-C 120-D 121-E)		NW-015889872.1
(197-A 198-B 199-C 200-D 201-E 202-F)		NW-015890969.1
(168-A 169-B 170-C 171-D 174-E)		NW-015930318.1
(198-A 225-B 231-C 255-D)
长度Size (bp)类型Classification长度Size (bp)类型Classification长度Size (bp)类型Classification长度Size (bp)类型Classification长度Size (bp)类型Classification
烤烟
Flue-cured tobacco		K326208B121E201E170C198
255		AD
NC89
205A121E201E170C198
225		AB
中烟100
Zhongyan 100		205A116
121		CE200D170C198
255		AD
LY1306214C121E198B170C198
255		AD
QY96205
208		AB121E201E170C231
255		CD
晾烟（白肋烟）
Air-cured tobacco		TN90
205
A
116
120		CD202F174E198
255		AD
(Burley tobacco)
TN86205A116
120		CD202F174E198
225		AB
晾烟（马里兰烟）
Air-cured tobacco
(Maryland tobacco)		WF1H220D114
121		AE199C171D198
255		AD
晒烟（雪茄烟）
Sun-cured tobacco
(Cigar filler)		茄芯1
Jiaxin1		205A116
120		CD201E169B198
255		AD
WM3H205A115
121		BE198A168A198
255		AD

Note: Size represent the size of the amplified fragment in different species (lines)

注：长度表示在不同品种（系）扩增出来的片段大小

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通过对不同类型的烟草重测序后的遗传标记进行试验验证研究,重测序后4个烟草样本（LY1306、QY96、WM3H、WF1H）结合NCBI已有的2个烟草品种（K326、TN90）,分析重测序品种的SSR位点以及InDeL位点,得出7个较为稳定的SSR多态性位点,通过PCR片段扩增,结果表明其中5个SSR遗传标记可以有效地把试验品种的遗传多样性和特异性进行区分,将5个SSR标记对10个不同类型烟草样本进行多态性位点的检测区分,结果表明,NW-015795276.1能将马里兰烟与白肋烟、烤烟明显区分,NW-015854676.1能够将烤烟、白肋烟、马里兰烟都分别区分,此外它可以将烤烟品种中的中烟100（ZY100）与其他4个烤烟品种（系）NC89、K326、LY1306、QY96区分开,还可以将晒烟品种Cigar1和WM3H区分开。NW-015889872.1能够将白肋烟和马里兰烟区分开,还可以将烤烟品种（系）中的LY1306和QY96、LY1306和ZY100、ZY100和QY96区分开,可用于区分晒烟中的Cigar1和WM3H。NW-015890969.1也能够将烤烟、白肋烟、马里兰烟明显区分,它还可以区分晒烟中的Cigar1和WM3H。NW-015930318.1能够将NC89、QY96与其余4种烤烟品种（系）区分,还能够将白肋烟品种TN86与TN90区分。NW-015795276.1、NW-015854676.1、NW-015889872.1这3个位点能够将烤烟类型不同品种（系）区分。由以上分析可得,NW-015795276.1、NW-015889872.1和NW-015930318.1可以将烤烟类型LY1306和QY96区分,表明LY1306与QY96虽同为烤烟类型,但其在根本基因序列存在很大差别。NW-015889872.1、NW-015854676.1和NW-015890969.1等3个SSR位点可有效区分烤烟、白肋烟和马里兰烟以及晒烟烟草类型。

3 讨论与结论

SSR标记能准确较快的分析纯度以及对种质资源进行区分,筛选出可用的位点以便分析应用。SSR标记运用于烟草方面起步较晚,且可用的位点较少。陈云等[7]利用聚类分析将马里兰烟和烤烟区分开,证明了SSR标记可用于烟草类型的划分。本试验中QY96和LY1306同为烤烟,同种类型烟草由于外观生长相似,难以区分不同品种（系）,SSR遗传标记可以将同类型不同品种（系）烟草（LY306和QY96）进行有效区分。

本研究基于烟草品种（系）重测序,对4个重测序品种（系）进行SNP和InDeL位点分析后得到7个候选SSR位点,并利用PCR技术对包括不同烟草类型在内的多个烟草品种（系）进行了验证,表明其中5个SSR遗传标记可以有效地对不同的烟草类型进行区分。对烤烟品系LY1306和QY96进行遗传鉴定与遗传分析,NW-015795276.1、NW-015889872.1和NW-015930318.1可以有效地将LY1306和QY96区分,NW-015889872.1、NW-015854676.1和NW-015890969.1等3个SSR位点可有效区分烤烟、白肋烟和马里兰烟以及晒烟烟草类型。本研究为烟草新品种（系）的遗传鉴定提供了新的遗传标记位点,在基因遗传水平上研究烤烟品系的差异性,将不同类型的烟草区分开,有效地区分同一类型不同品种（系）间的烟叶样本的差异性和特异性,可以用于对不同品种（系）和类型的烟草进行分类,为烟草遗传鉴定研究提供依据,为不同烟草类型间的鉴别分类提供准确可靠的标记位点,便于进行不同烟草类型间的区分分析。

The authors have declared that no competing interests exist.
作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献

刘齐元, 刘飞虎, 黄海泉 , 等.

烟草胞质雄性不育系与保持系线粒体DNA的RAPD分析

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用124个10碱基随机引物对烟草2对雄性不育系及其保持系线粒体DNA的RAPD分析表明,不育系与保持系间有112个引物未扩增出多态性片段,占引物总数的92.56%,这反映了不育系和保持系线粒体的同源性。同时,在不育系与保持系的线粒体基因组间也发现了明显的差异,这些差异片段与雄性不育的关系还需进一步研究。

朴红梅, 王玉民, 刘宪虎 , 等.

简单重复序列的研究与应用

吉林农业科学, 2017(6):11-15.

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SSR是以几个碱基为基本单元的串联重复序列,广泛分布于真核生物基因组中.SSR信息量高,覆盖整个基因组,共显性遗传,多态性水平高,易用PCR分析,是一种非常有用的分子标记.对SSR的种类、研究进展、以及SSR在品种鉴定、基因作图和标记辅助育种等方面的研究应用现状作了简要概述.

张志敏, 熊国梅, 王慧娟 , 等.

简单重复序列的筛选与应用

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综述目前简单重复序列 (SSR) 4种筛选方法的基本原理和主要步骤 ;介绍SSR标记在遗传多样性分析、遗传图谱构建、物种分类和系统发育研究及比较基因组学中的应用

罗玉娣, 李建国 .

SSR标记及其在蔬菜育种中的应用

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SSR(Simple Sequence Repeats,SSR)是指以1～6个串联核苷酸为单位的重复DNA序列.因每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大,从而形成其座位 的多态性.SSR操作程序包括DNA的提取、DNA的扩增、电泳及染色3个主要环节.SSR技术在蔬菜育种中有着广泛的应用,主要是构建遗传图谱、DNA 指纹图谱的建立、种质资源的遗传多样性等方面.

杨育峰, 史典义, 王雁楠 , 等.

基于转录组测序数据的甘薯SSR标记开发及群体聚类分析

分子植物育种, 2018,16(11):3569-3579.

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利用转录组数据开发SSR标记,是目前较为经济高效的DNA分子标记开发方法。为了开发更多适用于甘薯的SSR标记,本研究在前期对甘薯体细胞杂种KT1及其两个亲本4个干旱胁迫处理的24个样本转录组de novo测序的基础上,对获得的105 959条Unigene中大于等于1 000 bp的FASTA序列进行搜索,共找到12 105个SSR位点。从中筛选设计了200对SSR引物在KT1及其亲本中筛选验证,最终选择了20对多态性较好的引物,对来自不同地区的94份甘薯种质资源进行了群体聚类分析。聚类分析把94份实验材料分为3个亚群,较清晰地区分了不同材料之间的遗传相似性。这些基于甘薯转录组测序开发的SSR标记为甘薯的遗传多样性分析、辅助育种和遗传图谱构建等研究的开展提供了更加丰富的候选标记。

聂琼, 刘仁祥 .

23份烟草种质遗传多样性的SSR和ISSR标记分析

西南农业学报, 2011,24(1):15-19.

DOI:10.3969/j.issn.1001-4829.2011.01.004      URL     [本文引用: 1]

利用SSR和ISSR标记分析 23份烟草种质遗传多样性。结果表明:8个SSR引物和8个ISSR引物分别检测到66个和113个多态性位点。不同烟草种质之间的遗传相异系数在 0.3259~0.8588(SSR)或0.1369~0.8161(ISSR)。以SSR、ISSR标记分别聚类以及两种标记混合聚类均在0.63处将 23个材料分为4类:2个类群和2个独立个类Coker147、Val16或G140,一类群以红花大金元为基础聚类,另一类群以NC82为基础聚类。两 种标记的结果相似,均可用来进行烟草种质资源的遗传多样性分析。

陈云, 陈磊, 乐超银 .

马里兰烟SSR分子标记分析

湖北农业科学, 2014,53(6):1440-1441,1464.

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采用SSR分子标记分析了五峰7个主栽烟草（Nicotiana tabacum L.）品种.结果表明,6对引物共检测到22个多态位点,7个品种的遗传相似系数为0.347 8～0.9130.

Nicolas S, James N D B,Sonia O ,et al.

The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato

Nature Communications, 2014,5:1-9.

DOI:10.1038/ncomms4833      URL     PMID:4024737      [本文引用: 1]

The allotetraploid plant Nicotiana tabacum (common tobacco) is a major crop species and a model organism, for which only very fragmented genomic sequences are currently available. Here we report high-quality draft genomes for three main tobacco varieties. These genomes show both the low divergence of tobacco from its ancestors and microsynteny with other Solanaceae species. We identify over 90,000 gene models and determine the ancestral origin of tobacco mosaic virus and potyvirus disease resistance in tobacco. We anticipate that the draft genomes will strengthen the use of N. tabacum as a versatile model organism for functional genomics and biotechnology applications.

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NGSQC: cross-platform quality analysis pipeline for deep sequencing data

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Background While the accuracy and precision of deep sequencing data is significantly better than those obtained by the earlier generation of hybridization-based high throughput technologies, the digital nature of deep sequencing output often leads to unwarranted confidence in their reliability. Results The NGSQC ( N ext G eneration S equencing Q uality C ontrol) pipeline provides a set of novel quality control measures for quickly detecting a wide variety of quality issues in deep sequencing data derived from two dimensional surfaces, regardless of the assay technology used. It also enables researchers to determine whether sequencing data related to their most interesting biological discoveries are caused by sequencing quality issues. Conclusions Next generation sequencing platforms have their own share of quality issues and there can be significant lab-to-lab, batch-to-batch and even within chip/slide variations. NGSQC can help to ensure that biological conclusions, in particular those based on relatively rare sequence alterations, are not caused by low quality sequencing.

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The sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools

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