国内关于向日葵核型分析研究的相关报道已有一些。中国科学院武汉植物研究所刘惠荣等[1]对向日葵的3个品种进行了染色体组型分析,结果发现：3个向日葵品种的染色体组别与染色体数目有显著性差异。崔秋华等[2]在1989年对向日葵的染色体进行了核型分析,报道向日葵有4个随体。2007年,吉林大学刘海学[3]在“向日葵染色体核型及其遗传转化的研究”博士论文中提出：8个基因型向日葵的染色体数均为2n=2x=34,除了RHA266之外,都为中部着丝粒或近中部着丝粒染色体;8个基因型向日葵具备2种核型：1B和2B,表明不同基因型间染色体核型的确存在差别。从已有报道中可知,不同向日葵品种的染色体组型也不相同。由黑龙江省农业科学院提供的向日葵龙葵杂10号,已在黑龙江省被广泛种植了多年,但有关向日葵龙葵杂10号的染色体数目、形态、核型公式方面的研究尚没有报道,因此本研究旨在探索龙葵杂10号染色体的组成、核型特点,以期为杂交育种实践等提供有意义的遗传学方面的指导,为选育向日葵新品种、创造新类型提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于2018年3月在大庆师范学院遗传学实验室进行。试验用向日葵种子龙葵杂10号由黑龙江省农业科学院提供。龙葵杂10号向日葵种子经过根尖培养获得根尖细胞,对根尖细胞进行染色体制片和核型分析。
1.2 根尖培养和预处理
1.3 根尖细胞染色体制片
1.4 测量与计算
选取形态清晰、分散较好的染色体标本片图像在Photoshop7.0处理软件中测量染色体长度,再用Excel计算染色体相对长度、臂比等。
1.5 核型模式图绘制
利用Excel绘制图表的功能绘出核型模式图。首先将测得的染色体各种参数输入到Excel表格中,数据输入时短臂为正数,长臂为负数,随体也为正数。设置单元格格式：将长臂区域选定,然后右键设置单元格格式,选定数值,小数位数为2位。图表的插入：将数据区域选中(包括长臂、短臂、随体),插入图表,图表类型选择堆积柱形图,然后编辑标题和X、Y轴等处,再对坐标轴、网络线、图例等进行编辑。设置图表格式：选定坐标轴,右键弹出“坐标轴格式”对话框,在坐标轴选项中找到“标签”选项,然后将标签位置选为“低”,将“图标区格式”和“绘图区格式”的边框都设置为“无”,最后双击柱形图,把长臂区与短臂区的填充颜色全部改成黑色。
2 结果与分析
2.1 龙葵杂10号种子及根尖培养
龙葵杂10号种子黑色皮薄,容易萌发,在25℃的恒温培养箱中培养一段时间后,种子萌发出根尖（封底图版Ⅰ）。向日葵的根尖比较粗壮,主根一条,在培养中常常会出现分裂相参差不齐,找不到理想的中期分裂相的材料。因此将刚刚冒出根尖的材料进行8℃低温预处理,可以使之后的根尖生长整齐一致,便于获得更多的比较一致的分裂相,适合核型分析。
2.2 根尖细胞染色体制片与染色体核型分析
获得分散比较好的能进行核型分析的染色体制片,对这样的制片进行照相,统计染色体数目,对100张能统计染色体数目的照片进行观察,其中有34个细胞的染色体数目为34条,占统计的总细胞数的74%,因此确定龙葵杂10号的染色体数目为2n=34。利用Photoshop套索工具进行染色体配对,之后用A4纸打印出染色体图片,剪下染色体进行排列,得到染色体的核型图（封底图版Ⅱ）。
2.3 龙葵杂10号染色体核型模式图
图1
表1 龙葵杂10号染色体核型参数
Table 1
| 编号 Number | 相对长度Relative length (%) | 臂比（长臂/短臂） Ratio (Long arm/Short arm) | 类型 Type | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 长臂Long arm | 短臂Short arm | 总长Full length | |||
| 1 | 4.4±0.12 | 3.0±0.16 | 7.4±0.25 | 1.47±0.06 | m |
| 2 | 4.4±0.24 | 2.6±0.14 | 7.0±0.35 | 1.69±0.09 | m |
| 3 | 4.0±0.10 | 2.8±0.16 | 6.8±0.21 | 1.43±0.08 | m |
| 4 | 3.8±0.16 | 2.8±0.10 | 6.6±0.19 | 1.36±0.08 | m |
| 5 | 4.4±0.07 | 2.0±0.07 | 6.4±0.10 | 2.20±0.08 | sm |
| 6 | 3.2±0.12 | 3.2±0.07 | 6.4±0.14 | 1.00±0.04 | M |
| 7 | 3.6±0.07 | 2.4±0.10 | 6.0±0.07 | 1.50±0.09 | m |
| 8 | 3.2±0.16 | 2.8±0.07 | 6.0±0.21 | 1.14±0.04 | m |
| 9 | 3.6±0.16 | 2.2±0.10 | 5.8±0.10 | 1.64±0.14 | m |
| 10 | 3.2±0.14 | 2.6±0.07 | 5.8±0.12 | 1.23±0.08 | m |
| 11 | 3.6±0.16 | 2.0±0.07 | 5.6±0.20 | 1.80±0.08 | m |
| 12 | 3.0±0.07 | 2.4±0.10 | 5.4±0.07 | 1.25±0.08 | m |
| 13 | 2.8±0.16 | 2.6±0.16 | 5.4±0.24 | 1.08±0.08 | m |
| 14 | 2.8±0.12 | 2.4±0.19 | 5.2±0.26 | 1.17±0.09 | m |
| 15 | 2.8±0.07 | 2.4±0.07 | 5.2±0.12 | 1.17±0.03 | m |
| 16 | 2.6±0.14 | 2.0±0.07 | 4.6±0.19 | 1.30±0.06 | m |
| 17 | 2.4±0.16 | 2.0±0.07 | 4.4±0.20 | 1.20±0.07 | m |
3 结论与讨论
本研究表明根尖材料低温预处理对制片效果影响很大,在染色体制片中起着关键作用。在刚刚冒出根尖时对材料进行8℃低温预处理,之后根尖材料在固定之前用冰水混合物再次低温处理24h,经过这两步骤的低温预处理可以使有丝分裂同步,使染色体的形态更适合核型分析,制片时染色体易于分散,易于进行核型分析。本研究得到的核型分析结果和李懋学[15]的研究结果有差异,例如李懋学[15]得到的向日葵核型公式为2n=34=16m+8sm(4sat)+10st(2sat)。Suhaileh[16]报道的4个不同的向日葵品种其核型公式均为8M+16sm+10st(6sat);崔秋华等[2]得到的向日葵的核型公式为2n=34=24m+6sm(4sat)+4st(4sat);张长顺[17]得到的向日葵的核型公式为2n=2x=34=14m(2sat)+12sm(6sat)+4st+4t。本试验得到的向日葵的核型公式为2n=34=30m+2sm+2M,且没有随体染色体。比较核型公式可以看出,不同的品种之间分析结果差异较大。这些研究结果的差异是否代表这些品种之间的遗传差异,还要进一步对它们之间的杂交后代进行遗传分析。
在核型分析中使用Photoshop和Excel软件辅助测量和计算以及进行同源配对,使结果更准确,减少了手工测量的误差。Photoshop和Excel软件的操作更容易掌握,这两种软件在实验教学中使用更加灵活方便。对于有些染色体制片效果不是很理想的图像,应用Photoshop软件显得更容易进行同源配对;核型模式图的绘制中使用Excel软件更方便,图形比手动绘制的更准确。
参考文献
向日葵(H. annuus L.)三个品种的染色体组型分析
本实验通过向日葵三个品种:阿尔及利亚、北葵15、市售材料的染色体组型分析,观察到它们之间在染色体分组组成、具随体的染色体数目上都有明显差异。实验说明:向日葵的栽培品种间,存在着细胞学上的异质性。
向日葵(H. annuus L.)染色体核型分析
本试验通过对向日葵品种的染色体核型分析,得出2n=34=24m+6Sm(4SAT)+4St(4SAT)的结果。同已报道的某些向日葵品种染色体核型相比,最显著的差异表现在随体染色体数目上,本试验首次发现向日葵有4对染色体带有随体。
向日葵染色体核型及其遗传转化的研究
向日葵是世界上重要的油料作物和生物能源材料,在中国人民的饮食结构中是食用油的主要来源之一。由于向日葵是公认的难转化作物,其转化频率不高,并且重复性差,其主要原因是从转化的细胞或组织分化再生植株困难。因此,本研究主要内容之一是探讨向日葵离体培养再生难的问题,以促进向日葵植株再生技术日臻完善,不断提高植株再生频率。研究结果表明,向日葵不同基因型外植体在含适宜IAA、6-BA等激素的培养基中均较易形成愈伤组织;但愈伤组织分化不定芽的能力则较困难;不同基因型向日葵外植体的不定芽诱导率依次为子叶节下胚轴子叶真叶;诱导子叶节不定芽分化的适宜6-BA浓度为1.2mg/L,下胚轴为1.8mg/L,子叶为0.6mg/L,真叶却未见到诱导出不定芽;幼胚大小为≤2mm时,体细胞胚发生频率较高(45.5%);体细胞胚胎发生的适宜培养基为MS+0.4mg/L 2,4-D+120g/L蔗糖。 核型分析是细胞遗传学、染色体工程、基因定位、细胞分类学以及现代进化理论等学科的基本研究方法,对向日葵染色体核型进行分析,这将为向日葵的细胞学分类、选择杂交亲本组合、培育新品种及转基因向日葵的细胞学检测等方面提供细胞学依据。结果表明,8个基因型向日葵的染色体数均为2n =2x = 34,除了RHA266之外,都为中部着丝粒或近中部着丝粒染色体;8个基因型向日葵具有2种核型:1B和2B,这表明不同基因型间染色体核型确实存在差异。 随着生物技术的发展,转基因植物产业将成为21世纪新的经济增长点。我们的设想是在21世纪里,向日葵的基因工程将从单基因性状向多基因发展。也就是说把抗虫、抗病、高产等多种基因都组合在一起,得到更好的向日葵品种。同时还想利用转基因工程,把有益健康的基因转移到向日葵中去,以改良向日葵的品质,使向日葵生产的食品成为健康食品、功能食品、营养食品。另外,通过向日葵转基因工程,人们还想尽快培育出抗旱、抗碱、抗土地贫瘠、抗重金属污染的向日葵。由此看来,对转基因向日葵的研究和开发其前景是非常远大的。关于对类胡萝卜素合成的有关酶基因转化向日葵的研究,无论是国外,还是国内至今有关这方面的研究报道较少。本实验通过农杆菌介导法和花粉管通道法,用类胡萝卜素生物合成代谢途径中关键酶PSY和LycB基因转化向日葵,以期获得类胡萝卜素含量较高的优质油用向日葵,达到改善向日葵品质的目的。研究结果表明:转化受体筛选剂Hyg使用浓度为8mg/L较适宜;共培养时间3d为宜;侵染时间8min为宜;重悬液浓度OD600以0.6为佳;以干燥处理4h的子叶节为外植体进行遗传转化,子叶节抗性芽率较不处理有明显的提高;柱头滴加法和子房注射法导入目的基因较适宜的时间为授粉后4-6h;柱头滴加法的抗性植株率低于子房注射法;PCR、Dot blot及Southern的分子检测证明,目的基因PSY和LycB已整合进向日葵基因组中。
暴马丁香的染色体核型分析
DOI:10.16590/j.cnki.1001-4705.2015.11.031
URL
[本文引用: 1]
利用压片法对暴马丁香根尖细胞进行染色体制片,并进行核型分析,结果发现,暴马丁香染色体数目2n=46,核型公式K(2n)=2x=46=20m+20sm+6st,其中中部着丝点染色体(m)为10对,近中部着丝粒染色体(sm)为10对,近端着丝粒染色体(st)为3对,暴马丁香为二倍体,核型类型为2A型。
麦瓶草的染色体数目观察及核型分析
DOI:10.3969/j.issn.1004-9444.2015.04.020
URL
[本文引用: 1]
为了解麦瓶草的染色体数目和染色体核型特点,以麦瓶草的根尖为材料,采用常规压片法,观察其染色体数目并进行核型分析.结果表明：麦瓶草的染色体数目为2n=2 0,核型公式为2n=2x=6m＋4st,其中第1、2、6、7对为亚端部着丝粒染色体,第3、4、5、8、9、10对为中部着丝粒染色体.核型分类为基本对称型的2A型.
2个西藏白菜型油菜地方品种的核型分析及比较
为研究2个西藏白菜型油菜褐籽品种"嘎壤油菜"和黄籽品种"雪巴黄籽油菜"的细胞学信息,采用常规压片法进行核型分析及比较,结果表明:2个西藏白菜型油菜的染色体数目均为2n=20,二倍体,均由中部着丝粒和亚中部着丝粒染色体组成,有1对中部着丝粒染色体带有随体;染色体组成结构、核型参数具有一定的差异,褐籽品种的核型参数均大于黄籽品种.褐籽品种"嘎壤油菜"进化程度较高,为中间类型2B型,黄籽品种"雪巴黄籽油菜"的进化程度较低,较为原始,为对称类型1A型.
植物染色体标本的制备和染色体核型分析研究进展
DOI:10.3969/j:issn.2095-1191.2012.12.1958
URL
[本文引用: 1]
染色体是遗传物质的载体，植物染色体制片和核型分析技术是细胞遗传学中最基本、最常用的方法，在物种亲缘关系鉴定、染色体变异、杂种分析等方面得到广泛应用。文章从取材、材料预处理、材料固定、材料解离、染色体制片、染色与观察等方面综述了近年来植物染色体制片的改进方法，从传统手工分析、Photoshop软件分析、自动核型分析、流式细胞术等介绍了核型分析技术。并从提高制片技术，以获得更清晰可辨的中期染色体图像；在染色体制片中规范统一标准的仪器设备并建立一套统一的标准，便于比较不同研究者的结果，有利于植物分类和遗传的研究；提高数据统计和分析的方法，以降低实验成本等方面展望了今后植物核型分析的发展方向。
百合科4种植物染色体的核型比较
DOI:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.06.005
URL
[本文引用: 1]
采用植物染色体常规压片法[1],结合显微摄影技术[2],对百合科葱属4种植物:洋葱、大蒜、小根蒜、耐寒铁岭葱王进行了染色体核型分析。结果如下:洋葱、大蒜、耐寒铁岭葱王的染色体数目均为2n=2x=16。其核型公式分别为2n=2x=16=12m+2sm,2n=2x=4M+8m+4st,2n=2x=14m+2st.小根蒜染色体数目为2n=4x=32,为典型的四倍体。洋葱,耐寒铁岭葱王,小根蒜的核型比较相近,均属进化程度较低的2A型。大蒜核型与它们的差异较明显,为进化程度较高的2B型。
非洲菊常见品种的染色体核型与倍性分析
DOI:10.6054/j.jscnun.2016.10.006
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[本文引用: 1]
采用常规根尖压片技术对非洲菊3个常见品种的染色体进行核型分析,并用流式细胞仪检测其倍性.结果表明:供试的3个非洲菊品种均为二倍体."深圳5号"核型公式为2n=2x=50=2M_+34m+14sm,染色体相对长度系数组成为2n=6L+12M_2+24M_1+8S,按照STEBBINS标准核型分类属于"2C"核型,不对称系数AS.K%=60.09%."香槟"核型公式为2n=2x=50+B=36m+12sm+2st+B,染色体相对长度系数组成为2n=8L+10M_2+16M_1+16S,属于"2C"核型,不对称系数AS.K%=62.17%."大头粉"核型公式为2n=2x=50+B=34m+12sm+4st+B,染色体相对长度系数组成为2n=8L+8M_2+28M_1+6S,属于"2B"核型,不对称系数AS.K%=62.21%.综上所述,3个非洲菊品种的染色体长度、着丝点位置、B染色体的有无均不同,核型呈现多态性.
新疆野苹果的不同种下类型染色体核型分析
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.08.011
URL
[本文引用: 1]
【目的】新疆野苹果(Malus sieversii)是新疆伊犁地区的主要野生苹果种质资源,是中国苹果资源中的独特分支,加强该资源的研究对保护苹果种质资源的丰富性具有重大意义。对新疆野苹果的不同种下类型进行细胞学分类,探讨新疆野生苹果种下类型之间的亲缘关系,为新疆野苹果资源的保护、开发与利用提供科学依据。【方法】以采自伊犁的新疆野苹果24个种下类型为研究对象,在4月初至4月中旬,选取其幼嫩的茎尖,采用改进的适合新疆野苹果核型分析的染色体制片方法进行压片,并根据不同种下类型染色体数目及其相对长度、平均臂比等核型指标,观察分析新疆野苹果24个种下类型染色体的核型特征。【结果】(1)新疆野苹果24个种下类型均为二倍体,染色体数目为34条,所有种质染色体相对长度平均值为3.23μm,属小染色体。从着丝点位置观察,多数类型均含有不同数量的m和sm染色体,个别类型只有m染色体,核型公式为2n=2x=34=34m、2n=2x=34=30m+4sm、2n=2x=34=28m+6sm、2n=2x=34=32m+2sm等4种类型。从染色体长度观察,除了香酸野苹果和长柄红霞果以外,其他的类型均含有不同数目的长染色体(L)、中长染色体(M2)、中短染色体(M1)以及短染色体(s)等4种类型,没有发现随体。(2)染色体结构特征方面,新疆野苹果24个种下类型染色体的平均臂比为1.27—1.56,核型不对称系数为56.01%—63.39%。核型类型大部分为1A和1B型,也有个别的2A和2B;1A、1B、2A、2B所占的比例分别为41.67%、37.5%、8.33%和12.50%。(3)进化趋势图显示,黄圆野苹果最为特殊,其核型不对称系数最高(63.39%),其进化程度最高,其次是霍城圆果野苹果和清香野苹果,小花野苹果的进化程度最低(56.01%);其余20个种下类型进化趋势具有较高的一致性,趋势较为集中;其中,大扁心野苹果的进化程度最低。(4)聚类分析显示,24个种下类型分为3类,第一类包括9个种下类型,它们具有较高的核型特征相似性,大多数类型的平均臂比大于其他类型,结合进化趋势结果,发现它们的进化趋势比别的类群较高;第二类包括11个,核型类型大多数为1B、2A、2B;第三类4个类型,它们的平均臂比和核型不对称系数最小,核型类型属于1A和1B,说明这类群的遗传相对稳定。【结论】新疆野苹果24个种下类型的核型特征有一定差异,根据核型特征,可以对其进行分类;与传统分类方法比较,其揭示的种下类型之间的亲缘关系更加明晰,聚类结果更能反映出类型之间的一致性与差异性。结合核型特征可初步判断种下类型的进化趋势,这对进一步研究新疆野苹果种下类型的系统进化有重要参考作用。
植物细胞染色体倍性鉴定方法
DOI:10.3969/j.issn.1006-6500.2001.02.011
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综述了植物细胞染色体倍性鉴定的染色体计数法、流式细胞分析法、检测气孔大小及气孔保卫细胞叶绿体数目法等各种检测方法 ,并对其优缺点进行了评述
Nomenclature for centromeric postion on chromosomes
Cytological studies in subfamily (Carduoideae) of Janpan:IX. The karyotype analysis
DOI:10.15281/jplantres1887.76.32 URL [本文引用: 1]
Chromosomes and evplution in higher plants. London;
几种油料植物的核型分析
四种油料植物的核型分析结果如下:红花,2n=24=20m(2SAT)+4sm(2SAT);向日葵,2n=34=16m+8sm(4SAT)+10st(2SAT);蓖麻,2n=20=20m(2SAT);文冠果,2n=30=18m(2SAT)+12sm。
Karyotype analysis of four varieties of H. annuus
DOI:10.1508/cytologia.44.319 URL [本文引用: 1]
