1 烟草花粉活力检测方法
花粉的形态、酶活性、淀粉含量往往和花粉活力密切相关。因此可通过观察花粉形态特征、检测淀粉含量和过氧化物酶或脱氢酶活性的高低、在离体培养条件下统计花粉萌发比例来表示花粉活力的高低。检测花粉活力的方法主要有4种,即形态观察法、离体萌发法、染色法和直接授粉法。
活力水平不同的花粉在形态上有差异。发育正常的花粉内含物充实饱满,形状规则,整齐一致,具有活力;而发育不正常的花粉内含物不充实,花粉粒小、空秕、皱缩、畸形,没有活力[5]。这种方法一般需要借助扫描电镜,但准确性差,一般只用于要求不严格的新鲜花粉的活力测定。何川生等[6]利用激光共聚焦扫描显微镜（LSCM）观察了37个烤烟、晒烟和野生烟品种的花粉,结果发现,烟草不同品种的花粉和萌发孔在形态和大小上存在明显差异,可以作为依据来研究烟草的分类和进化。李树美[7]将光学显微镜结合扫描电镜,研究了烤烟、白肋烟、晒烟、香料烟等4种不同类型烟草的花粉形态特征,也有类似的发现。目前还没有利用形态观察法检测烟草花粉活力的报道。
花粉萌发率是评价花粉活力水平的重要指标。正常发育成熟的花粉粒一般活力较强,在适宜条件培养基中能够萌发,通过统计花粉萌发比例来确定花粉活力。离体萌发法简单、迅速、合理,是较为理想的花粉活力鉴定方法。邓盛斌等[8]利用10%蔗糖+0.015%硼酸的琼脂培养基研究了不同花粉介质（可溶性淀粉、蔗糖和葡萄糖）对云烟87花粉萌发的影响,结果发现这些介质均可以不同程度的促进烟草花粉的萌发。目前在烟草上主要使用液体培养基来测定花粉活力。研究表明,云烟97和红花大金元花粉适宜的液体培养基组分为10％~15％蔗糖+25mg/L硼酸,蔗糖和硼酸浓度过高会导致花粉萌发率下降[9]。白肋烟B37花粉在3%葡萄糖+50mg/L硼酸+20mg/L CaCl2培养基中萌发率为86.8%,在10%蔗糖+50mg/L硼酸+20mg/L CaCl2培养基中萌发率为91.3%[10]。周小利等[11]研究表明,适宜K326、N. stocktonii、N. alata和N. repanda花粉萌发的硼酸和Ca2+浓度均是0.05g/L,适宜K326、N. alata花粉萌发的蔗糖浓度是10%,适宜N. stocktonii、N. repanda花粉萌发的蔗糖浓度则是12%。离体萌发法操作简单,准确性高,是烟草花粉活力检测中比较理想的方法。但不同烟草类型间培养基组分和浓度存在差异,需要进一步的试验来筛选出适合不同烟草类型的培养基配方。
染色法即利用染色剂和花粉中的酶发生氧化还原反应产生颜色以检测花粉活力。氯化三苯基四氮唑（TTC）可以将有活力的花粉染成红色[12],联苯胺可以将有活力的花粉染成棕色[13],而无活力的花粉不被染色。由于花粉细胞质膜的完整性不同,荧光染色剂可以使活细胞发出绿色荧光,而死细胞无荧光[14]。其他常用的染色剂还有甲基噻唑基四唑（MTT）、醋酸洋红、碘-碘化钾（I-KI）、中性红和亚甲基蓝等[15]。染色法操作简单快速,但未发育成熟、败育或不育、衰老甚至死亡的花粉也会被染色,往往使测定值偏高。有研究报道,TTC染色法对烟草花粉粒染色程度不易区分且重复性差,与实际情况也有差别[10]。廖雪芳等[16]利用I-KI染色法检测了云烟87、K326、净叶黄等8个品种顶花和侧花的花粉活力后发现,烟草新鲜花粉的活力均为100%。孙光玲等[17]比较了TTC法、I-KI法、联苯胺-α萘酚法和蔗糖-硼酸-琼脂固体培养基对6个不同类型烟草品种花粉活力的检测结果,发现染色法测定的花粉活力显著高于萌发法,但二者变化趋势一致,即萌发法测定的花粉活力高的,染色法测的结果也高,反之亦然。丁永乐等[18]的研究指出,通过TTC法和I-KI法测定烟草花粉活力的结果较高,需要在实际应用时去除一定的假象。
2 烟草花粉活力的影响因素
2.1 遗传特性
2.2 发育时期
2.3 温度
温度对花粉活力有着重要的影响。廖菊够等[29]研究发现,N. stocktonii减数分裂时期和小孢子的发育容易受到低温的影响。在昼温31℃照光14h、夜温11℃不照光10h条件下生长的N. stocktonii,发育成熟的新鲜花粉的萌发率为68%~74%,显微镜下观察到其在减数分裂期间异常现象出现较少,微核出现较少,比例较低;而在昼温25℃照光14h、夜温3℃不照光10h条件下生长的N. stocktonii生成的花药大多干瘪,发育成熟的新鲜花粉萌发率较低,一般为10%~16%,且在减数分裂期间观察到染色体桥、断片、不同步以及落后染色体等异常现象,并且微核出现比例较高。
2.4 化学物质
研究表明,γ-氨基丁酸（GABA）可以通过调节Ca2+和K+的流动来调节烟草花粉管的生长[32]。周小利等[11]研究表明,在0.7~1.0mmol/L范围内,GABA提高了K326、N. repanda和N. stocktonii花粉的萌发率,而3mmol/L的GABA则会抑制这3个烟草品种花粉的萌发。此外,N. alata的花粉在加Ca2+的培养基（10%蔗糖+0.05g/L硼酸+0.05g/L Ca2+）上萌发率为92%,在不加Ca2+的培养基（10%蔗糖+0.05g/L硼酸+1mmol/L GABA）上萌发率为91%,GABA和Ca2+在促进烟草花粉萌发方面可能具有类似的功能。花粉萌发时,吡咯喹啉醌可以加快花粉呼吸速率、提供能量和碳骨架、维持酶活性[33]。刘卫群等[34]研究表明,浓度为10、50和100μmol/L的吡咯喹啉醌均可以促进NC89花粉的萌发和花粉管的伸长,以100μmol/L促进效果最好,可能是由于吡咯喹啉醌激发了花粉萌发期间的一些酶的活性。Ylstra等[35]研究表明,成熟的烟草花粉中含有促进花粉萌发的物质,这些物质主要是黄酮醇类。此外,离体培养试验表明,0.15~1.50μmol/L浓度范围内所有黄酮醇类槲皮素、山奈酚和杨梅素均能对烟草花粉萌发率和花粉管长度具有强烈的刺激作用,并且黄酮醇类可以缩短双核中期的花粉达到成熟的时间。Ylstra等[35]指出,黄酮醇类的作用类似于植物激素,可以作为雄配子体发育过程中的一种植物生长调节剂。索文龙等[36]研究表明,在K326和云烟87的花期喷施精胺、亚精胺和腐胺,可以增加花粉内源多胺含量,提高保护酶超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶的活性,减少有害物质丙二醛积累,提高花粉活力;而喷施多胺合成抑制剂与之作用完全相反,喷施多胺合成抑制剂7~8h后再喷施腐胺,可以部分恢复花粉内源多胺含量和花粉活力。因此,多胺可以作为烟草花期调控花粉活力的调节剂,以此来提高花粉活力和授粉效率,达到节工降本的效果[36]。
2.5 其他
3 烟草花粉的采集和贮藏
郑昀晔等[26]研究表明,随着烟草单花花期的推进,花粉活力逐渐升高,K326、云烟85、云烟87在始开期和盛开期的花粉活力最高;同时授粉结果表明,这2个时期的花粉授粉后的坐果率、种子产量和质量均好于其他时期,且两者之间差异不显著;但是盛开期的花朵已经完全绽开,花药大多开裂,而始开期的花朵还没有绽开,花药也未开裂,为了保证花粉的纯度,适宜采集始开期花朵的花粉。邓盛斌等[28]研究表明,K326、红花大金元、云烟87等中心花开后40d以内花粉活力无显著变化,均高于80%,40d以后花粉活力显著下降,花粉活力和单花花粉数量随着花期的推进逐渐降低。牛永志等[27]研究表明,云烟85中心花开放1~40d采集的花粉授粉效率和种子产量与质量较好,40d后的花粉授粉后,坐果率明显下降,50d后的花粉授粉后,种子单株产量显著下降。
烟草花粉在贮藏过程中对环境条件的基本要求是干燥和低温,其耐贮藏性较好。研究表明,使用加入生石灰的干燥器贮藏5d后的G80和NC89的花粉活力比广口瓶普通贮藏花粉活力高17%,普通贮藏20d后,花粉完全失去活力,而在干燥器中可以保存到30d[18]。Green[31]研究表明,用胶囊盛装NC95的花粉置于含有硅胶的玻璃瓶中5℃下可以贮藏12个月,-17℃下可以贮藏90个月。孙光玲等[17]研究了红花大金元、沙姆逊、护脖香、土耳其雪茄和N. rustica等5个不同烟草品种的花粉在不同贮藏环境下的活力变化后,发现花粉在室内自然温湿度、室温干燥、冷藏干燥和冷冻干燥条件下的寿命分别为12、30、180和500d以上[17]。花粉在超低温（<-180℃）条件下代谢活动基本停止,能够实现长期贮藏[38]。古吉等[4]研究表明,K326、云烟87的花粉在5℃、-4℃和-18℃条件下随着贮藏时间的延长花粉活力逐渐下降,环境温度越高,活力丧失的越快,一般保存时间为6~9个月,而花粉在-196℃液氮中贮藏1年之后,活力仍处于较高水平。研究指出,烟草花粉的短、中期贮藏,宜将花粉含水量控制在5％~7％范围内,然后根据需要放置到5℃、-4℃和-18℃冰箱中,长期贮藏需保存在-196℃液氮中。
4 展望
进入21世纪后,使用烟草不育系和杂交种的种子已成为世界烟叶生产的趋势。不育系和杂交种在制种过程中必须进行人工授粉,高活力的花粉带来高受精结实率和高种子产量与质量。花粉活力受到品种、生育时期、温度、化学物质等诸多因素的影响。目前的研究大多针对花粉活力本身开展,相对单一,需要系统研究适宜的父本栽培技术,探究花粉成熟过程中花粉形态和超微结构变化,内含物变化,基因转录和蛋白表达变化,将花粉活力与花粉形态结构、内含物变化、特异基因和差异蛋白联系起来,确定烟草花粉成熟特征因子和最佳收集时期,构建烟草花粉质量综合评价方法。
低温冷冻技术能够大幅度提高花粉活力保持的时间,使花粉能作为种质资源进行长期保存,对解决品种选育、改良过程中“花期不遇”的难题具有重要意义。前人的研究主要针对不同贮藏温度对花粉活力的影响,对花粉含水量、贮藏温度、贮藏介质、贮藏时间、冷冻和解冻方式以及冻存花粉的授粉效果、种子产质量和后代遗传稳定性还缺乏系统性的研究,搞清楚这些问题就能完善烟草花粉贮藏和介质花粉技术,为烟草种子生产创造有利条件。
参考文献
The intrafloral phenology of streptantus tortuosus (Brassicaceae). American
茶花花粉生活力及贮藏力的研究
以茶花花粉为试材，采用培养基法研究了不同离体培养茎、不同花粉贮藏时间及不同品种花粉的生活力及贮藏力。结果表明：供试的7个品种最高萌发率均达到90％以上，其中“天山粉”在M1培养基中萌发率最高，达到98．349／6，5个品种的花粉萌发率在不同培养基中的差异达到显著性；贮藏时间对花粉萌发率有显著影响，“葡萄汁”在贮藏50d时，花粉萌发率由低温贮藏30d时的87．87％锐减为贮藏50d时的3．18％，贮藏70d时，其萌发率仅为2．02％；不同品种间低温贮藏70d的茶花花粉贮藏力存在极显著性差别，“红露珍”花粉在低温贮藏70d后，仍有38．16％的萌发率，而“葡萄汁”与“歌女”萌发率仅为2．02％和2．69％，已基本失去活性。
烟草花粉活力鉴定方法筛选
DOI:10.3969/j.issn.1007-5119.2013.04.017
[本文引用: 2]
以白肋烟B37花粉为试验材料，对花粉活力鉴定方法进行了分析比较，并设计了培养配方、培养温度、培养时间等15种花粉活力鉴定方法。结果表明，花粉离体培养萌发测定花粉活力是较为理想的烟草花粉活力鉴定方法，其中葡萄糖（3％）＋硼酸（50mg／L）＋CaCL2（20mg／L）、蔗糖（10％）＋硼酸（50mg／L）＋CaCL2（20mg／L）25℃恒温暗箱保湿培养3h，花粉萌发率最高，新鲜花粉活力分别为86．8％和91.3％。
Viability and germination of the pollen of sorghum (Sorghum bicollor)
DOI:10.1093/aob/74.1.27 URL [本文引用: 1]
Studies on longevity of pollen grains of rice,Oriza sativa L. Morphological change of pollen grains after shedding
DOI:10.1508/cytologia.36.104 URL [本文引用: 1]
不同花粉介质对烤烟授粉效果及种子质量的影响
DOI:10.3969/j.issn.1004-390X.2010.04.004
[本文引用: 1]
为保证烤烟不育系和杂交种的种子质量及产量,降低种子生产成本, 本试验采用可溶性淀粉、纯藕粉和葡萄糖粉与云烟87纯花粉按重量比0.5:1,1:1,2:1和3:1的比例分别混合配成介质花粉,以纯花粉为对照,研究 不同花粉介质对烤烟授粉效果和种子质量的影响.结果表明:在纯花粉中添加适量的花粉介质授粉,可以提高雄性不育(MS)云烟87成果率、单果粒数和单果种 子重量,且不影响种子质量.其中,可溶性淀粉和葡萄糖粉作为花粉介质效果较好,与纯花粉分别按照1:1和0.5:1的重量比混合后授粉,成果率分别显著提 高了6.86%和5.13%(P<0.05),单果粒数分别显著提高了14.07%和10.89%(P<0.05),单果种子重量分别显著提 高了14.68%和10.34%(P<0.05),对种子质量影响不显著.该技术应用于烤烟不育系和杂交种种子生产,能节约花粉用量,降低单位重量 种子的生产成本.
枣树单花不同开放阶段花粉萌发率和内源激素的变化
以‘冬枣’和‘湖南鸡蛋枣’为试材, 研究了单花不同开放阶段花粉萌发率和内源激素的变化。枣树单花不同开放阶段的花粉萌发率不同, 湖南鸡蛋枣以萼片展平期花粉萌发率最高, 冬枣以初开期最高。冬枣花粉萌发率在整个花期始终小于3%。冬枣单花开放过程中较高水平的内源乙烯及低水平的赤霉素和玉米素与花粉萌发率低有关。鉴于冬枣的花粉萌发率极低而胚高度可育, 且鲜食品质极佳, 可以作为鲜食枣杂交育种的理想母本材料。
不同花期花粉授粉对烟草授粉效果和种子质量的影响
DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2012.26.020
[本文引用: 2]
[目的]为确定烟草花粉的适宜采集时期。[方法]采集不同花期的花粉,研究不同花期花粉授粉 对云烟85、云烟87和K326授粉效果和种子质量的影响。[结果]随着花粉采集花期的延长,花粉活力逐渐提高;对于云烟85、云烟87和K326,始开 期和盛开期的花粉授粉效果好,种子产量和质量高。[结论]在保证种子产量、质量和纯度的基础上,宜采集始开期花粉进行授粉。
GABA对烟草花粉管Ca 2+和K +的动态调节表明离子通道参与了花粉管生长的调控
Coenzyme PQQ and the oxidation of SH residues in proteins
Flavonols stimulate development,germination,and tube growth of tobacco pollen
DOI:10.1104/pp.100.2.902 URL [本文引用: 2]
Cryopreservation of delphinium pollen at -30℃
DOI:10.1023/A:1019931304742 URL [本文引用: 1]
