目前,至少有69个抗稻瘟病位点共84个主效基因已被定位[4]。据报道已开发了大量与抗稻瘟病基因连锁的分子标记,例如早期被克隆出来的2个抗稻瘟病基因Pi-ta与Pi-b[5,6],基于其本身序列开发了特异性分子标记[7],在水稻抗稻瘟病分子检测中已被广泛应用。定位于水稻11号染色体上的Pik-m是Pik上的一个主效抗病等位基因[8],其与Pik、Pik-h、Pik-p和Pik-s是等位基因[9]。抗病基因Pik-m对病菌具有较宽的抗谱,在水稻抗病育种中的利用价值很大[10]。水稻抗稻瘟病基因Pi9来源于小粒野生稻。Qu等[11]2006年克隆了该抗稻瘟病基因,位于水稻6号染色体,在多达13个国家的43个稻瘟病菌株上可以表现出较高的抗性[12],在利用分子标记辅助选择技术来改良稻瘟病抗性中,是使用最广泛的主效抗性基因之一[13]。20世纪60年代中期,山崎等对日本主要水稻品种进行抗瘟性分类,命名了13个抗病基因,其中包括Pia、Pii、Pik等[14]。从地谷中分离出来的一个主效稻瘟病抗性基因Pi-d3,其cDNA长为2 970bp,其中包含了2个外显子,编码了一个由923个氨基酸组成的蛋白产物,产物含有MHD基序和NBS-LRR结构域,对稻瘟病生理小种表现较高的抗病能力[15]。
黑龙江省是中国重要的水稻种植区,稻瘟病的发生造成水稻大量减产甚至绝产。本研究选取6个抗瘟基因,据了解很多在我国水稻种植区具有较高利用率且具有较好的抗性[16],利用已开发的稻瘟病抗性基因位点的功能分子标记,对黑龙江省34份主栽水稻种质资源进行分子检测,明确其在黑龙江水稻种质资源中的分布情况,以期为黑龙江省水稻品种合理布局及抗瘟品种的选育提供理论指导。
1 材料与方法
试验于2018年在黑龙江省植物抗性研究中心完成。
1.1 供试品种
黑龙江省主栽的34个水稻品种：龙粳21、龙粳26、龙粳29、龙粳31、龙粳40、龙粳42、龙粳43、龙粳45、龙粳46、龙粳50、龙粳52、龙粳53、松粳3、松粳15、松粳20、绥粳4、中龙粳1号、龙洋1号、龙洋10、龙洋16、北稻3、北稻4、垦稻12、垦稻23、垦稻26、垦稻30、垦稻31、垦稻32、龙庆稻3号、稻花香2号、空育131、稼禾1号、三江16、莎莎泥;供体抗病对照材料为单基因品种K1（Pi-ta）、BL1（Pi-b）、T suyuake（Pik-m）、Oryza minuta（Pi9）、Fujisaki 5（Pii）、地谷（Pi-d3）;以丽江新团黑谷（LTH）为感病对照。试验材料均由黑龙江省植物抗性研究中心提供。
1.2 DNA提取及引物
采用室内水培法培育水稻,在四叶期取新鲜叶片,利用OMEGA植物基因组提取试剂盒（HP Plant DNA Kit）,按照提取说明书步骤提取水稻基因组DNA。用于目的基因PCR扩增反应的引物名称、序列及其扩增片段预期大小见表1。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
表1 PCR引物序列、扩增片段大小
Table 1
| 目的基因Target gene | 引物名称Primer name | 引物序列(5′→3′) Primer sequence (5′→3′) | 预期片段大小Expected size (bp) | 酶Enzyme |
|---|---|---|---|---|
| Pi-ta | Pi-ta F Pi-ta R | AGCAGGTTATAAGCTAGGCC CTACCAACAAGTTCATCAAA | 1042 | - |
| Pi-ta | Npi-ta F Npi-ta R | AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT CTACCAACAAGTTCATCAAA | 1042 | - |
| Pi-b | Pi-b F Pi-b R | GAACAATGCCCAAACTTGAG GGGTCCACATGTCAGTGAGC | 365 | - |
| Pi-b | Npi-b F Npi-b R | TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT GGGAAGCGGATCCTAGGTCT | 803 | - |
| Pik-m | Pik-m1 F Pik-m1 R | TGAGCTCAAGGCAAGAGTTGAGGA TGTTCCAGCAACTCGATGAG | 174（抗）/213 | - |
| Pik-m | Pik-m2 F Pik-m2 R | CAGTAGCTGTGTCTCAGAACTATG AAGGTACCTCTTTTCGGCCAG | 290（抗）/332 | - |
| Pi9 | Pi9 F Pi9 R | GCTGTGCTCCAAATGAGGAT GCGATCTCACATCCTTTGCT | 291（抗）/397 | - |
| Pii | Pii F Pii R | TCCAATGCTTCTGAAAGGTAGC TGGAAACATGAACCCATATCCT | 355 | PvuⅡ |
| Pi-d3 | Pi-d3 F Pi-d3 R | TACTACTCATGGAAGCTAGTTCTC ACGTCACAAATCATTCGCTC | 658 | BamHⅠ |
1.3 PCR扩增及电泳检测
PCR反应体系总体积20µL：ddH2O 14.7µL、2.0µL 10×Buffer（含Mg2+）、1.6µL dNTP、每种引物各0.3µL、0.1µL Taq酶（TaKaRa）、DNA模板1µL。
PCR扩增程序为：94℃预变性3min;94℃变性30s,55℃~60℃（按特定引物设定）退火30s,72℃延伸30~60s,共35个循环;72℃延伸10min,4℃保存。
其中Pi-ta、Pi-b、Pik-m、Pi9的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测,Pii、Pi-d3的酶切产物通过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,利用凝胶成像系统拍照分析。
2 结果与分析
2.1 Pi-ta与Pi-b基因功能性标记的分子检测
图1
图1
Pi-ta、Pi-b基因扩增结果
M,DL2 000;A、B中泳道1-K1（Pi-ta）,C、D中泳道1-BL1（Pi-b）;泳道2-LTH;泳道3~泳道36为选取的34份水稻品种
Fig.1
The results of Pi-ta, Pi-b gene amplification
M, DL2 000; Lane 1-K1 (Pi-ta) in A, B; Lane 1-BL1 (Pi-b) in C, D; Lane 2-LTH; Lane 3-Lane 36 are 34 rice varieties selected
2.2 Pik-m与Pi9基因功能性标记的分子检测
图2
图2
Pik-m、Pi9基因扩增结果
M,DL2 000;A、B中泳道1-T suyuake（Pik-m）,C中泳道1-Oryza minuta（Pi9）;泳道2-LTH;泳道3~泳道36为选取的34份水稻品种
Fig.2
The results of Pik-m, Pi9 gene amplification
M, DL2 000; Lane 1-T suyuake (Pik-m) in A, B; lane 1-Oryza minuta (Pi9) in C; Lane 2-LTH; Lane 3-Lane 36 are 34 rice varieties selected
2.3 Pii与pi-d3基因功能性标记的分子检测
图3
图3
Pii、Pi-d3基因酶切检测结果
M,DL2 000;A中泳道1-Fujisaki 5（Pii）PCR产物,B中泳道1-地谷（Pi-d3）PCR产物;A中泳道2-Fujisaki 5（Pii）酶切产物,B中泳道2-地谷（Pi-d3）酶切产物;泳道3-LTH PCR产物;泳道4-LTH酶切产物;泳道5~泳道38为选取的34份水稻品种
Fig.3
The results of enzyme digestion of Pii and Pi-d3
M, DL2 000; Lane 1-Fujisaki 5 (Pii) PCR product in A, Lane 1-Digu (Pi-d3) PCR product in B; Lane 2-Fujisaki 5 (Pii) digestion product in A, Lane 2-Valley (Pi-d3) digestion product in B; Lane 3-LTH PCR product; Lane 4-LTH digestion product; Lane 5 to Lane 38 are 34 rice varieties selected
2.4 黑龙江省主栽水稻品种稻瘟病抗性基因检测结果
选取的黑龙江省主栽的34份水稻品种通过利用已开发的抗瘟基因Pi-ta、Pi-b、Pik-m、Pi9、Pii、Pi-d3的功能性分子标记进行检测（表2）,结果显示有19份供试材料中含有Pi-ta抗性基因,占供试品种的55.9%;含有Pi-b抗性基因的有8份,占供试品种的23.5%;含有Pik-m抗性基因的有18份,占供试品种的52.9%;含有Pi9抗性基因的有24份,占供试品种的70.6%;含有Pii抗性基因的有8份,占供试品种的23.5%;含有Pi-d3抗性基因的有1份,占供试品种的2.9%。
表2 供试品种抗性基因分子标记检测结果
Table 2
| 编号 Numbering | 品种Variety | 抗性基因Resistance gene | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Pi-ta | Pi-b | Pik-m | Pi9 | Pii | Pi-d3 | ||
| 1 | 龙粳21 Longjing 21 | - | - | + | + | - | - |
| 2 | 龙粳26 Longjing 26 | - | - | + | - | - | - |
| 3 | 龙粳29 Longjing 29 | + | - | - | + | + | - |
| 4 | 龙粳31 Longjing 31 | + | - | + | - | - | - |
| 5 | 龙粳40 Longjing 40 | - | - | - | - | - | - |
| 6 | 龙粳42 Longjing 42 | - | - | - | - | - | - |
| 7 | 龙粳43 Longjing 43 | - | + | - | + | + | - |
| 8 | 龙粳45 Longjing 45 | + | - | + | + | - | - |
| 9 | 龙粳46 Longjing 46 | - | - | + | + | - | - |
| 10 | 龙粳50 Longjing 50 | + | - | - | + | - | - |
| 11 | 龙粳52 Longjing 52 | - | - | + | + | + | - |
| 12 | 龙粳53 Longjing 53 | + | - | + | + | - | - |
| 13 | 松粳3 Songjing 3 | + | - | - | + | + | - |
| 14 | 松粳15 Songjing 15 | - | + | + | + | - | - |
| 15 | 松粳20 Songjing 20 | + | + | + | + | + | - |
| 16 | 绥粳4 Suijing 4 | + | - | - | + | - | - |
| 17 | 中龙粳1 Zhonglongjing 1 | - | + | + | + | - | - |
| 18 | 龙洋1号 Longyang 1 | + | - | + | - | - | - |
| 19 | 龙洋10 Longyang 10 | - | + | - | + | - | - |
| 20 | 龙洋16 Longyang 16 | + | + | - | - | + | + |
| 21 | 北稻3 Beidao 3 | + | - | + | + | + | - |
| 22 | 北稻4 Beidao 4 | + | + | + | + | - | - |
| 23 | 垦稻12 Kendao 12 | - | - | + | - | - | - |
| 24 | 垦稻23 Kendao 23 | - | + | - | - | - | - |
| 25 | 垦稻26 Kendao 26 | + | - | - | + | - | - |
| 26 | 垦稻30 Kendao 30 | + | - | - | - | - | - |
| 27 | 垦稻31 Kendao 31 | + | - | + | + | - | - |
| 28 | 垦稻32 Kendao 32 | + | - | + | - | - | - |
| 编号 Numbering | 品种Variety | 抗性基因Resistance gene | |||||
| Pi-ta | Pi-b | Pik-m | Pi9 | Pii | Pi-d3 | ||
| 29 | 龙庆稻3号Longqingdao 3 | + | - | - | + | - | - |
| 30 | 稻花香2号Daohuaxiang 2 | + | - | - | + | + | - |
| 31 | 空育131 Kongyu 131 | - | - | + | + | - | - |
| 32 | 稼禾1号Jiahe 1 | + | - | - | + | - | - |
| 33 | 三江16 Sanjiang 16 | - | - | - | + | - | - |
| 34 | 莎莎泥Shashani 16 | - | - | + | + | - | - |
| LTH | - | - | - | - | - | - | |
| 检出频率Detection frequency (%) | 55.9 | 23.5 | 52.9 | 70.6 | 23.5 | 2.9 | |
Note: "+", the gene was detected; "-", the gene was not detected
注：“+”,检测到该基因;“-”,未检测到该基因
2.5 稻瘟病抗性基因在黑龙江省主栽水稻品种中的分布
6个抗瘟基因在黑龙江省主栽水稻品种中均可被检测到,但分布差异较大。其中Pi9基因出现频率高达70.6%,Pi-ta、Pik-m的出现频率均在50%以上。在松粳20中检测到5个稻瘟病抗性基因,占总供试品种的2.9%;含有4个稻瘟病抗性基因的有3个品种,分别是龙洋16、北稻3、北稻4,占供试品种的8.8%;含有3个稻瘟病抗性基因的有龙粳29、龙粳43、龙粳45等10个品种,占供试品种的29.4 %;含有2个稻瘟病抗性基因的有龙粳21、龙粳31、龙粳46等13个品种,占供试品种的38.2%;含有1个稻瘟病抗性基因的有龙粳26、垦稻12、垦稻23等5个品种,占供试品种的14.7%;其中龙粳40、龙粳42不含有待检测基因。
3 讨论
稻瘟病菌具有生理分化现象,且它的变异速度较快,一些抗病水稻品种推广3~5年后表现出逐渐丧失抗病性,了解品种本身的抗性基因型在针对品种抗性改良中尤为重要[23]。如今越来越多的研究人员对各地区水稻品种的抗瘟基因型进行了分子检测。王亚等[22]利用Piz-t、Pik-m、Pit、Pi25、Pi-d2及Pi-d3抗性基因对河南主要水稻品种进行了检测,明确了以上基因的分布情况。陈峰等[24]利用4个抗瘟基因对黄淮区粳稻进行了抗稻瘟病基因检测,并发现Pik-m与稻瘟病抗性综合指数显著相关。张银霞等[25]利用Pi-ta、Pi-b、Pi9对宁夏水稻种质资源进行了检测,为宁夏水稻分子标记辅助育种奠定了基础。
本研究利用Pi-ta、Pi-b、Pik-m、Pi9、Pii、Pi-d3对黑龙江省34份主栽水稻种质资源进行特异性分子检测,结果显示,水稻品种一般含有多个抗瘟基因,其中Pi9检出频率最高,说明其在黑龙江水稻育种中应用较广泛,仅有1个品种含Pi-d3基因,说明黑龙江省水稻品种中Pi-d3较缺乏,与其他地区水稻品种抗瘟基因检测结果相比较,可以发现不同地区间抗稻瘟病基因在水稻种质资源中的分布具有差异。王军等[26]研究表明,Pi-ta和Pi-b基因的联合效应与穗颈瘟抗性存在正相关,并且这种相关性比2个基因单独存在与穗颈瘟抗性的相关性要紧密。本研究中Pi-ta检出频率为55.9%,Pi-b检出频率为23.5%,在今后的育种中,可以适当加强对Pi-b基因的利用。
于连鹏等[27]通过水稻苗期接种稻瘟病菌测定了部分黑龙江省种植的水稻品种的抗性频率以及联合抗病性系数,发现不同品种间的抗性频率具有很大差异。本研究发现松粳20含有5个被检测抗瘟基因,龙粳31含有2个被检测基因,龙粳40不含有被检测基因,其综合表现均为抗病;龙庆稻3号和绥粳4号含有2个被检测基因,其综合表现均为中抗;龙粳21含有2个被检测基因,表现为中度感病。结合其抗病表现可以看出,品种含有抗性基因数目与品种的抗性频率之间无明显联系,是否将越多的抗性基因整合到同一品种中,其表现的抗性就会强于含有较少抗性基因的品种或单基因品种还需要进一步考证。
根据目前的研究发现,针对水稻抗瘟基因的检测限于主效基因中的一部分。本试验只检测了6个水稻稻瘟病抗性基因的分布,水稻品种在田间的抗性表现还可能与未检测到的抗瘟基因、水稻品种的联合种植、抗瘟基因的聚合、种植的环境条件、抗性基因是否表达、菌株致病性等多方面因素相关,在后续研究中将扩大抗性基因检测范围并综合多方面因素,为进一步发掘黑龙江省抗稻瘟病种质资源和优化布局提供更有力的理论依据。
参考文献
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DOI:10.1046/j.1365-313X.1999.00498.x URL [本文引用: 1]
水稻抗稻瘟病Pib基因的分子标记辅助选择与应用
【目的】为探索抗稻瘟病Pib基因的分子标记用于水稻抗稻瘟病辅助选育，36个四川地方稻瘟病菌株被用来检测Pib基因的抗性。同时利用检测感病等位基因Pib的显性标记Lys145，并结合前人报道的检测抗病等位基因Pib的显性标记Pibdom组成一套水稻抗稻瘟病基因Pib显性分子标记。【方法】利用这套水稻抗稻瘟病基因Pib显性分子标记对122个杂交稻亲本或材料进行分子鉴定，并分别采用稻瘟病菌株05-12（ZB13）和05-30（ZC15）单小种接种试验进行致病性测试。【结果】所检测的122个杂交稻亲本或材料中，只有7个杂交稻亲本或材料含抗病基因Pib，且对稻瘟病菌菌株ZB13和ZC15表现抗病反应。此外，利用这套水稻抗稻瘟病基因Pib显性分子标记对600个杂交F2代单株进行早期筛选，得到185个抗病基因Pib纯合的单株，田间抗性调查结果与抗病基因分子检测结果一致。【结论】该套显性分子标记可应用于水稻抗稻瘟病基因Pib的分子标记辅助选育。
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The Pikm gene,conferring stable resistance to isolates of Magnaporthe oryzae,was finely mapped in a crossover-cold region on rice chromosome 11
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The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice
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Two broad-spectrum blast resistance genes,Pi9(t) and Pi2(t),are physically linked on rice chromosome 6
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Rapid survey for presence of a blast resistance gene Pi-ta in rice cultivars using the dominant DNA markers derived from portions of the Pi-ta gene
Development of DNA markers suitable for marker assisted selection of three,genes conferring resistance to multiple,pathotypes
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Two adjacent nucleotide-binding site-leucine-rich repeat class genes are required to confer Pikm-specific rice blast resistance
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Pi-ta、Pi-b基因在江苏粳稻穗颈瘟抗性育种中的价值分析
DOI:10.3969/j.issn.1000-7091.2012.06.028
Magsci
[本文引用: 1]
利用稻瘟病抗性基因<em>Pi-ta</em>、<em>Pi-b</em>的功能标记对2009,2010年江苏省粳稻中间试验的部分粳稻品系进行基因型检测,结合穗颈瘟抗性结果,通过关联分析<em>Pi-ta</em>、<em>Pi-b</em>在江苏省粳稻穗颈瘟抗性中的价值。结果表明:<em>Pi-ta</em>、<em>Pi-b</em>基因与江苏省粳稻穗颈瘟的抗性呈正相关,<em>Pi-ta</em>基因2009,2010年的相关系数分别为0.50,0.37;<em>Pi-b</em>基因2009,2010年的相关系数分别为0.55,0.51;<em>Pi-ta</em>、<em>Pi-b</em>基因的联合效应与穗颈瘟抗性正相关系数分别为0.71,0.62。因此,同时携带这2个抗病基因可以大大提高江苏省粳稻穗颈瘟抗性。
