（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性先升高后降低。该研究结果对橄榄油加工废液的处理与应用具有参考价值。

油橄榄（Olea europaea L.）是一种常绿经济乔木,其果实富含脂肪,榨取的果油具有多种保健功效^[1,2]。在橄榄油榨取加工过程中,会产生大量的果渣和废液。而含有果渣油、多酚和萜类化合物等多种活性成分的橄榄油加工废弃物在国内均未得到有效的高值化利用,造成了极大的资源浪费和环境污染^[2,3]。随着油橄榄种植面积不断扩大、产量不断增加,橄榄油加工废弃物大量排放,不仅污染环境,也造成资源浪费^[4,5,6]。国外学者研究发现,橄榄油加工废弃液对土壤的短期影响主要表现为土壤物理、化学和生化特性的改变,例如微生物生物量、基础呼吸、可溶性C和N、土壤水解酶和氧化还原酶活性的变化,同时,由于橄榄油加工废弃液存在的植物毒性使番茄种子的发芽能力大大降^[7]。Roberto等^[8]以不同浓度的橄榄油加工废弃液作为泥碳替代物添加到草莓的无土栽培基质中,发现在草莓早期生长发育中产生了轻微的毒性,抑制了草莓的生长和发育^[8]。另有研究表明,低浓度的橄榄油加工废弃液对小麦和玉米种子萌发和生长具有积极的诱导作用,而高浓度会产生严重的抑制作用^[9]。邹光友^[3]将橄榄油加工废弃果汁用碱液处理后,发现果汁中的有效成分没有发生明显变化,还制成了饮用果汁饮料,这一研究结果提示碱液处理使废弃液发生了温和的碱化作用。

甘肃省陇南市武都区及周边文县、康县是中国最大的油橄榄种植区,占全国油橄榄种植面积的95%以上,鲜榨橄榄油的企业和工作中心数量也很多,但是鲜榨所产生的果汁废液没有得到很好的利用。为此,本研究采用Na₂CO₃处理橄榄油加工废弃液,用不同浓度的碱化废弃液处理陇南当地主要种植农作物玉米的种子,观察其对种子萌发、幼苗生长以及生理特性的影响,为橄榄油废弃物肥料化利用以及农田环境保护提供参考。

供试材料为陇南当地主要种植玉米品种中单9409,购自陇南市武都区种子公司。橄榄油加工废弃液由陇南市武都区油橄榄中心初榨车间提供。HgCl₂、磷酸盐、Tris碱、HCl、愈创木酚、邻苯二酚、考马斯亮蓝G-250等所有试剂均为分析纯。

1.2.1 碱化橄榄油加工废弃液制备 参照Zbakh等^[5]的方法测定橄榄油加工废弃原液的主要组成及pH等理化特性,然后用蒸馏水将于4℃保存的橄榄油加工废弃原液稀释成浓度为100%、80%、70%、50%、30%、20%和10%的溶液各500mL,分别用滤纸过滤,取上清液备用。用不同浓度的Na₂CO₃溶液处理橄榄油加工废弃液,筛选出0.10%为Na₂CO₃最佳处理浓度,碱液处理后pH值为6.9~7.0。取0.1g Na₂CO₃溶解到100mL蒸馏水中作为0.10%的碱液备用。另取原液按照0.10%的浓度称取适量的Na₂CO₃充分溶解其中,用滤纸过滤后取上清液,分别用蒸馏水将上清液稀释成浓度为60%、50%、40%、30%、20%和10%的溶液各200mL备用。

1.2.2 种子萌发测定 参照叶文斌等^[6,10]的方法,将玉米种子用流水冲洗干净,用0.1%HgCl₂消毒处理8min,再用流水和蒸馏水冲洗3次,用滤纸吸干表面水分后均匀点播在铺了2层滤纸的培养皿中,每皿50粒,重复3次,在培养皿中分别加入100%、80%、70%、50%、30%、20%、10%稀释浓度的橄榄油加工废弃液2.5mL进行胁迫处理。以蒸馏水培养为对照,用CK(0)表示;以0.10%的Na₂CO₃为碱对照,用CK(0.1)表示。将各处理的玉米种子置入25℃的光照培养箱中暗培养,3d后开始记录萌发情况,参考叶文斌等^[10]的方法计算种子的萌发率和萌发指数。将60%、50%、40%、30%、20%、10%的橄榄油加工废弃液均用0.10%的Na₂CO₃处理后,分别用K(60)、K(50)、K(40)、K(30)、K(20)、K(10)来表示。按照上述同样的方法计算种子的萌发率、萌发指数,计算玉米幼苗整齐度,幼苗整齐度=幼苗平均株高/幼苗株高标准差。

1.2.3 幼苗生长测定 参照叶文斌等^{[10,11,12,13]}的方法,将准备好的细砂在103.4kPa、121.3℃高温条件下灭菌20min后,装入直径25cm的小花盆中作为培养基质,每盆培养25株玉米幼苗,3次重复,用0.10% Na₂CO₃处理后浓度为60%、50%、40%、30%、20%、10%的橄榄油加工废弃液分别在每个花盆中加入25mL,以蒸馏水为对照(CK),每隔24h补充25mL培养液和蒸馏水1次,用透明保鲜袋将花盆封口,以防止水分蒸发和不同处理间的相互影响。将花盆置于恒温25℃、光照550lx（12h/d）、湿度75%的智能温室培养。于第15天测定玉米幼苗的根长和苗高,将根与苗分开,用排水法^[11]测定根的体积后,置于105℃的烘箱中杀青30min,再调至75℃烘至恒重,称量每25株的干质量。

1.2.4 生理生化指标的测定 在智能温室培养15d后取健康玉米幼苗植株顶部第2、3片全展叶测定可溶性糖含量、游离脯氨酸和丙二醛（MDA）含量^[4],超氧阴离子O₂^-·产生速率和H₂O₂含量,超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性^[14]。

用SPSS 17.0软件统计分析数据,所有数据用单因素方差分析比较进行显著性检验,P<0.05表示显著差异,P<0.01表示极显著差异,数据均用平均数表示。

橄榄油加工废弃液经不同浓度Na₂CO₃处理后的主要组成和理化特性如表1所示,橄榄油加工废弃原液pH为4.6,酸性较强,经过0.10% Na₂CO₃碱化处理后pH为6.96,接近7.00,酚类物质和有机酸含量降低合理,说明碱化处理后酸碱调整科学合理,没有碱性残留,不会对环境造成二次污染或再次形成盐碱环境。0.05% Na₂CO₃碱化处理后pH为5.39,仍为酸性,酚类物质和有机酸含量降低不明显;0.20% Na₂CO₃碱化处理后pH为8.36,酚类物质和有机酸含量降低明显,Na累积较多,会对环境造成二次污染或再次形成盐碱环境。所以本研究选取0.10% Na₂CO₃碱化处理后的橄榄油加工废弃液。

0.10% Na₂CO₃和橄榄油加工废弃液对玉米种子萌发率的影响如图1所示,在废弃液浓度为10%~30%时玉米种子萌发率有升高的趋势,种子萌发指数也有相同的趋势。其中,10%和20%废弃液处理的种子萌发率低于CK(0),两者之间无显著差异（P>0.05）,但又高于0.10% Na₂CO₃处理或CK(0.1);废弃液浓度为30%处理种子萌发率高于CK(0),两者之间无显著差异（P>0.05）。30%~100%废弃液浓度时,随着废弃液浓度的升高种子萌发率逐渐降低;当橄榄油加工废弃液稀释浓度为70%时玉米种子的萌发率降低到49.25%,与CK(0)和CK(0.1) 相比较有极显著的差异（P<0.01）;当橄榄油加工废弃液浓度为100%时,玉米种子萌发率已降低到20%左右,萌发指数仅为95.6。因此,通过Na₂CO₃碱化处理筛选后,确定橄榄油加工废弃液稀释浓度为60%、50%、40%、30%、20%和10%,这一选择和叶文斌等^[10]对小麦的研究结果一致。

如图2所示,随着橄榄油加工废弃液浓度的升高,玉米种子萌发率呈现出先升高后降低的的趋势,种子萌发指数也有相同的趋势,其中10%和50%处理玉米种子萌发率低于CK(0),两者之间无显著差异（P>0.05）,但又高于CK(0.1),碱化废弃液浓度为60%处理玉米种子萌发率低于CK(0.1);其中碱化废弃液浓度为30%处理种子萌发率最高,达到96.77%,与CK(0)存在显著差异（P<0.05）,与CK(0.1)存在极显著差异（P<0.01）。40%碱化废弃液处理玉米种子萌发率与CK(0)相比有所升高,但两者之间无显著差异（P<0.05）;50%和60%碱化废弃液浓度对玉米种子的萌发产生了明显的抑制作用（P<0.05）,当碱化废弃液浓度为60%时玉米种子萌发率为83.67%,萌发指数为336.93,与CK(0)和CK(0.1)相比均存在极显著差异（P<0.05）。

如图3所示,当碱化废弃液浓度为10%时,玉米幼苗的苗高、根长和根体积均低于CK(0),20%~40%碱化废弃液处理的玉米幼苗苗高、根长和根体积均高于CK(0);当碱化废弃液浓度为50%和60%时,玉米幼苗苗高、根长和根体积均低于CK(0)。其中碱化废弃液浓度为30%时玉米幼苗生长情况和生物量的积累都明显好于CK(0)（P<0.01）,说明20%~40%的碱化废弃液对玉米幼苗生长具有一定的促进作用。

如图4所示,废弃液经过0.10% Na₂CO₃碱化处理后,随着碱化废弃液浓度的升高幼苗整齐度表现出先高后低的趋势,30%~40%碱化废弃液处理玉米幼苗整齐度高于CK(0),即幼苗整齐度保持较高水平,其中30%处理玉米幼苗整齐度最高;10%、20%和50%处理玉米幼苗整齐度低于CK(0),高于CK(0.1);60%碱化废弃液处理玉米幼苗整齐度均低于CK(0)和CK(0.1)。说明30%~40%废弃液经过0.10% Na₂CO₃碱化处理后对玉米成苗的能力具有较好的促进作用。

如图5所示,随着碱化废弃液浓度的升高,玉米幼苗叶片中可溶性糖、游离脯氨酸和MDA含量呈现先升高后降低再升高的趋势。当碱化废弃液浓度为60%时,玉米幼苗叶片中可溶性糖、MDA和游离脯氨酸含量均最高,当碱化废弃液浓度为10%时,3项指标含量均高于CK(0),但低于CK(0.1),当碱化废弃液浓度为20%~40%时,3项指标含量均低于CK(0),且存在显著差异（P<0.05）。当碱化废弃液浓度为30%时,玉米幼苗叶片中可溶性糖、MDA和游离脯氨酸含量均低于CK(0)（P<0.01）,说明20%~40%的废弃液经过0.10% Na₂CO₃碱化处理后其活性成分发生了拮抗作用,降低了对玉米幼苗的伤害作用,启动了玉米幼苗的自我保护机制。

如图6所示,碱化橄榄油加工废弃液浓度为10%、50%和60%时,玉米幼苗叶片中O₂^-·产生速率和H₂O₂含量均高于CK(0),但均低于CK(0.1);浓度为20%~40%时,玉米幼苗中O₂^-·产生速率和H₂O₂含量与CK(0)相比均较低（P<0.05）,与CK(0.1)相比,O₂^-·产生速率和H₂O₂含量降低极显著（P<0.01）,其中碱化废弃液浓度为30%时玉米幼苗中O₂^-·产生速率和H₂O₂含量最低。说明20%~40%的废弃液经过0.10% Na₂CO₃碱化处理后可以降低其对玉米幼苗的氧化损害,同时提高玉米幼苗的抗逆作用。

如图7所示。碱化橄榄油加工废弃液浓度为10%、50%和60%时,玉米幼苗中SOD、POD、CAT和APX等4种保护酶活性均高于CK(0.1),但均低于CK(0)。当浓度为20%~40%时,玉米幼苗中4种保护酶活性均高于CK(0)和CK(0.1),其中碱化废弃液浓度为30%处理玉米幼苗4种保护酶活性最低。说明20%~40%的橄榄油加工废弃液经过0.10% Na₂CO₃碱化处理后显著提高了玉米幼苗清除O₂^-·和H₂O₂能力,降低氧化损伤,提高了玉米植株的抗氧化功能,这一研究结果与叶文斌等^[10]对小麦的研究结果一致。

橄榄油加工废弃液用0.10% Na₂CO₃碱化处理后pH值为6.96,接近7.00,酚类物质和有机酸含量降低合理,说明碱化处理后酸碱调整科学合理,没有碱性残留,不会对环境造成二次污染或形成盐碱环境。本研究中,废弃液碱化处理后处理玉米种子,结果显示,随着碱化废弃液浓度的升高,玉米种子萌发和幼苗生长及生理生化指标都呈现先升高后降低的趋势。当碱化废弃液浓度为40%~60%时,O₂^-·产生速率升高,H₂O₂大量积累,可溶性糖、MDA和游离脯氨酸含量升高明显,SOD、POD、CAT和APX保护酶活性降低明显。而浓度为30%的碱化废弃液能显著促进玉米种子萌发和幼苗生长,可能与橄榄油加工废弃液中的糖类、酚酸类、氮化物、矿物质和酚类多种营养物质在碱性环境发生了复杂的化学反应,降低了这些成分对玉米生长的综合抑制效应,表现出了积极的促进生长作用,这和叶文斌等^[10]对小麦的研究结果相似。酚酸类物质是以化感形式来完成应激作用的,化感作用会导致体内活性氧增多,造成膜质过氧化,提高SOD、CAT和苯丙氨酸酶活性,从而破坏膜结构^[10,15]。植物在逆境胁迫下都会存在较高的膜脂过氧化水平,也会保持较高的保护酶活性^{[6,9-10,16-19]},而无逆境胁迫时,植物细胞中存在着高效的抗氧化系统来维持活性氧产生与清除的平衡^[20,21,22]。

叶文斌等^[6,10]研究表明,用高浓度橄榄油加工废弃液对红芪、小麦处理后,产生了大量的可溶性糖、脯氨酸和MDA,同时也提高了叶片中O₂^-·产生速率和H₂O₂含量;刘娜等^[9]研究表明,橄榄油加工废弃液对种子萌发及生长产生的毒性可能与多酚及氧化产物使种子萌发所需的关键酶类、糖类等多种营养物质发生生物酸化和污染等而产生毒害有关。用橄榄油加工废弃液对玉米幼苗进行处理发现,玉米幼苗为了适应橄榄油加工废弃液胁迫,产生反映膜脂过氧化程度的MDA^[19],同时也刺激细胞膜透性改变^[5,6],破坏细胞壁上纤维素分子间的桥键,抑制蛋白质的合成,显著增加脯氨酸的含量^[11,12,13],引发幼苗中SOD、POD、CAT和APX活性升高来主动清除H₂O₂和O₂^-·以减轻对玉米的伤害。当橄榄油加工废弃液经Na₂CO₃碱化处理后,废弃液成分和pH都发生了变化,当废弃液浓度较高时,虽然发生了碱化作用,但碱化后复杂的成分依然会对玉米生长发育产生抑制影响,从而刺激产生大量的可溶性糖、脯氨酸和MDA,促使幼苗叶片中O₂^-·产生速率升高和H₂O₂含量增加,引发幼苗中SOD、POD、CAT和APX活性升高,从而破坏膜的结构并最终导致玉米幼苗的伤害^[5-6,10]。

适宜的碱化废弃液浓度对玉米的生长和发育均产生了促进作用,提高了玉米成苗的能力,废弃液经过0.10% Na₂CO₃碱化处理后,pH值为6.96,接近7.00,酚类物质和有机酸含量降低合理,糖类含量升高,同时总氮含量合理升高,使碱化处理后酸碱调整更加科学合理,碳源和氮源供应充足,适宜玉米萌发和幼苗的生长,同时钠的含量保持在较低水平,不会对环境造成二次污染或形成盐碱环境。