作物杂志, 2019, 35(3): 73-79 doi: 10.16035/j.issn.1001-7283.2019.03.012

遗传育种·种质资源·生物技术

农杆菌介导谷子成熟胚遗传转化体系的建立与优化

李颜方, 杜艳伟, 张正, 王高鸿, 赵根有, 赵晋锋, 余爱丽

山西省农业科学院谷子研究所,046011,山西长治

Establishment and Optimization of Agrobacterium Mediated Transformation System for Mature Embryo of Foxtail Millet

Li Yanfang, Du Yanwei, Zhang Zheng, Wang Gaohong, Zhao Genyou, Zhao Jinfeng, Yu Aili

Millet Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Changzhi 046011, Shanxi, China

通讯作者: 赵晋锋为通信作者,副研究员,研究方向为遗传育种

收稿日期: 2018-11-15   修回日期: 2018-12-21   网络出版日期: 2019-06-15

基金资助: 国家现代农业技术体系项目.  CARS-06-13.5-A23
山西省农业科学院科技自主创新能力提升工程项目.  2017ZZCX-09
山西省农业科学院特色农业技术攻关.  YGG17021
山西省农业科学院农业科技创新项目.  YCX2018206

Received: 2018-11-15   Revised: 2018-12-21   Online: 2019-06-15

作者简介 About authors

李颜方,助理研究员,研究方向为遗传育种; 。

摘要

为建立一个稳定的谷子遗传转化体系,对216份谷子种质资源进行筛选,确定材料178成熟胚为受体材料,从植物激素浓度、防褐化剂、农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度等方面对谷子再生及转化体系进行优化。结果表明,在MS培养基中加入生长素2,4-D 9μmol/L、细胞分裂素Kinetin 4μmol/L、硝酸银8mg/L,愈伤组织诱导率最高且能有效防止褐化。在侵染液和共培养基中加入100μmol/L AS,gus表达效果最好。农杆菌溶液OD600为0.3~0.5,侵染15min,共培养3d时,抗性愈伤组织率最高。获得的转基因植株,经PCR检测及gus染色分析,确定外源bar基因已成功整合到谷子基因组中。初步建立了一套谷子遗传转化体系,为今后谷子遗传转化提供一些参考。

关键词: 谷子 ; 农杆菌 ; 成熟胚 ; 遗传转化 ; 愈伤组织

Abstract

In this study, we developed the foxtail millet in vitro transformation system by using Agrobacterium mediated based on screening 216 foxtail millet varieties to obtain high quality embryo callus. Calli induced from mature seeds of variety 178 as explants. The Agrobacterium strain LBA4404 harboring binary vector pCAMBIA 3301 which contained β-glucuronidase (gus) as the reporter gene, transformed into embryogenic callus for optimizing transformation conditions. For infection with Agrobacterium, calluses derived from shoot apex explants were prepared and submerged in bacterial suspension for different durations, meanwhile the concentration of AS in co-cultivation medium was optimized. Resistant calli were gained by selecting them on a medium containing phosphinothricin and kanamycin. Transformed plants were obtained from the resistant calli after differentiation and regeneration. The target gene was detected by gus activity assay and PCR analysis of bar gene. These results indicated the foreign gene has been integrated into the genome of millet and can be effectively expressed.

Keywords: Foxtail millet ; Agrobacterium ; Mature embryos ; Genetic transformation ; Callus

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本文引用格式

李颜方, 杜艳伟, 张正, 王高鸿, 赵根有, 赵晋锋, 余爱丽. 农杆菌介导谷子成熟胚遗传转化体系的建立与优化[J]. 作物杂志, 2019, 35(3): 73-79 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2019.03.012

Li Yanfang, Du Yanwei, Zhang Zheng, Wang Gaohong, Zhao Genyou, Zhao Jinfeng, Yu Aili. Establishment and Optimization of Agrobacterium Mediated Transformation System for Mature Embryo of Foxtail Millet[J]. Crops, 2019, 35(3): 73-79 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2019.03.012

谷子(Setaria italica)是重要的粮食作物和饲草作物,具有抗旱、耐瘠、抗逆性强、适应性广、营养丰富等特点[1,2]。谷子属于区域性小杂粮作物,相关生物技术研究相对薄弱,功能基因的开发进展缓慢。目前,转基因技术为谷子的功能基因研究提供了新的平台,许多重要的抗性基因相继被发掘、克隆,但是功能验证却相对滞后,主要原因是谷子的遗传转化效率较低,因此迫切需要构建一套稳定有效的遗传转化体系。

在众多的转基因方法中,农杆菌介导法由于操作简单、效率高和拷贝数少等优点备受人们关注[3]。农杆菌介导法多以幼穗、幼胚、成熟胚等为外植体,利用农杆菌侵染特性把外源基因导入谷子基因组中。虽然报道有获得转基因植株成功的例子[4,5,6,7,8,9],但仍存在遗传转化效率较低,转化体系不稳定等问题。本试验以此为切入点,探索谷子高效遗传转化的方法,主要从愈伤组织预培养时间、菌液浓度、侵染时间和乙酰丁香酮浓度等方面进行研究,为建立一套高效稳定的谷子遗传转化体系提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料及培养基配方

本试验供试的谷子材料有晋谷21、沁州黄、长生04等216份,试验所用根癌农杆菌菌种LBA4404、带有gus基因的质粒pCAMBIA3301均由山西省农业科学院谷子研究所保存。用于试验的各种培养基见表1

表1   试验所用的培养基

Table 1  Media used in experiment

培养基Media培养基组分Medium composition
愈伤组织诱导培养基(A)
Calli inducing medium
MS培养基+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L Kinetin+40g/L麦芽糖+35mg/L ZnSO4·7H2O+0.6mg/L CuSO4·5H2O+
8mg/L AgNO3+4g/L植物凝胶,pH 5.8
分化培养基(B)
Differential medium
MS培养基+2.0mg/L Kinetin+20g/L麦芽糖+7g/L Phytoblend(植物凝胶类似物),pH 5.8
农杆菌悬浮侵染培养基(C)
Suspending medium
MS培养基+40g/L麦芽糖+35mg/L ZnSO4·7H2O+0.6mg/L CuSO4·5H2O+100μmol/L乙酰丁香酮(AS)+1g/L泊洛沙姆,pH 5.8
共培养基(D)
Co-cultural medium
MS培养基+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L Kinetin+40g/L麦芽糖+35mg/L ZnSO4·7H2O+0.6mg/L CuSO4·5H2O+
100μmol/L AS+1g/L泊洛沙姆+4g/L植物凝胶,pH 5.8
筛选分化培养基(E)
Screening and differentiation medium
分化培养基+150mg/L特美汀+5mg/L草丁膦,pH 5.8
筛选再生培养基(F)
Screening and regeneration medium
MS培养基+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L Kinetin+40g/L麦芽糖+35mg/L ZnSO4·7H2O+0.6mg/L CuSO4·5H2O+
4g/L植物凝胶+150mg/L特美汀+10mg/L草丁膦,pH 5.8
生根培养基(G)
Rooting medium
1/2 MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L Phytoblend,pH 5.7

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1.2 试验方法

1.2.1 适宜组织培养的基因型筛选 本试验于2016年起在山西省农业科学院谷子研究所基因转化室内进行。本试验从216份谷子材料中筛选愈伤组织诱导率较高的基因型,作为后期受体材料,具体方法为:成熟种子去皮用70%酒精溶液处理30s(期间轻轻晃动),无菌去离子水冲洗4次,无菌滤纸吸干种子表面水分,0.1% HgCl2溶液处理5min,无菌去离子水冲洗4次,均匀置于A培养基上(40~50粒/皿)。将培养皿置于24℃组培室暗培养2~3d。待种子芽尖长到4~6mm时,在无菌条件下将芽尖转移到新的A培养基上。每2周继代1次,继代2次后观察愈伤组织状态并记录。

1.2.2 植株再生条件优化 选取生长良好且长势一致的愈伤组织接种到A培养基上,培养基中添加抗褐化剂硝酸银(分别为2、4、6、8、10、12mg/L),以不添加任何抗褐化剂的处理为对照。每个处理接种10皿,每皿接种30块愈伤组织,重复3次。分别统计愈伤组织褐化率。愈伤组织褐化率(%)=褐化的愈伤组织块数/接种的总愈伤组织块数×100。

培养基中添加适量的生长素和细胞分裂素对愈伤组织的诱导有重要作用。对生长素2,4-D设置浓度梯度为6、9、12、15μmol/L,对细胞分裂素Kinetin设置浓度梯度为2、4、6、8μmol/L,每个浓度处理设6个重复,每个重复取30粒成熟种子,成熟种子诱导培养21d后统计愈伤组织诱导率,愈伤组织转入B培养基30d后统计再生率。愈伤组织诱导率(%)=产生愈伤组织的种子数/接种的种子总数×100;再生率(%)=再生出幼苗的愈伤组织块数/用于再生的总愈伤组织块数×100。

1.2.3 根癌农杆菌转化试验 谷子的根癌农杆菌转化参考刘颖慧等[10]的方法并加以改进。挑取5个根癌农杆菌3301/LBA4404单菌落,在YEB培养基(含100mg/L卡那霉素与125mg/L利福平)中振荡培养至OD600达0.4~0.6,5 000r/min、20℃离心10min收集菌体,用C培养基重悬菌体。将C培养基中的菌稀释到适当浓度(OD600=1.0),侵染愈伤组织15min后,将愈伤组织置于滤纸上晾干20min,转移到D培养基上,22℃暗培养3d后,用溶有150mg/L特美汀的灭菌去离子水清洗,转到E培养基上,24℃暗培养约16~20d,淘汰死亡和褐化严重的愈伤组织,保留质地疏松、颜色淡黄、生长良好的抗性愈伤组织并记录。抗性愈伤组织率(%)=抗性愈伤组织块数/侵染的总愈伤组织块数×100。

1.2.4 gus组织化学检测 gus活性的组织化学检测参考Jefferson方法[11]。将置于D培养基3d的愈伤组织浸在gus染色液中,37℃恒温过夜,染色完成后,用75%乙醇进行脱色至对照愈伤组织颜色时进行比较观察,拍照记录结果并计算gus表达率。gus表达率(%)=gus染色阳性愈伤组织块数/染色的总愈伤组织块数×100。

1.2.5 转化植株的分子检测 用CTAB法提取谷子叶片基因组DNA,以组织培养得到的未转化植株为阴性对照,质粒为阳性对照,PCR检测:以bar基因为扩增对象。上游引物:5′-GCGGTCTGC-ACCATCGTC-3′,下游引物:5′-GTACCGGCAGGC-TGAAGTCCA-3′。PCR反应条件为:94℃预变性3min;30个循环(94℃30s;56℃30s;72℃40s);72℃7min,4℃保存。

2 结果与分析

2.1 适宜组织培养的谷子基因型筛选

基因型是影响农杆菌转化效率的一个重要因素,不同基因型之间转化效率差异显著[12,13,14]。本试验选取216份谷子材料的成熟种子在A培养基上进行愈伤组织诱导,继代2次后统计愈伤组织诱导率,愈伤组织诱导率大于60%以上的材料有21份,占供试材料总数的9.7%;根据愈伤组织的质量,淘汰愈伤组织较小、分生能力弱、形态黄褐色易水渍化的材料,最终确定8份材料进行下一步的转化试验。8份材料的愈伤组织经农杆菌溶液侵染后筛选抗性愈伤组织并进行gus染色分析,结果详见表2。根据抗性愈伤组织率、抗性愈伤组织生长状态以及gus染色结果,材料178的愈伤组织呈淡黄色硬颗粒状,组织状态最好,后期分化成苗状况也良好,确定其作为受体材料进行遗传转化体系的建立。

表2   适宜组织培养的谷子基因型

Table 2  Genotype of millet suitable for tissue culture %

材料编号
Material code
基因型
Genotype
发芽率
Rate of germination
愈伤组织诱导率
Rate of callus induction
抗性愈伤组织率
Rate of resistance callus
gus表达率
Rate of gusexpression
19豫谷1号Yugu 183.584.232.611.4
50长农35 Changnong 3580.583.135.825.3
63长生06 Changsheng 0668.585.318.97.5
125长生07 Changsheng 0780.581.724.619.2
129沁州黄Qinzhouhuang96.687.212.63.9
164冀谷11 Jigu 1178.472.648.735.3
168金谷1号Jingu 191.586.834.219.5
178晋谷21 Jingu 2182.679.642.538.9

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2.2 硝酸银浓度对愈伤组织褐化的影响

愈伤组织转接到新的培养基中,有时会出现褐化现象,主要是由于愈伤组织受伤后,释放的酚类物质被氧化成褐色的醌类物质。在组织培养过程中,添加抗褐化剂是控制褐化现象发生的常见方法,而最理想的抗褐化剂是既能控制褐化又不影响愈伤组织的正常生长。文献[15,16]报道硝酸银作为乙烯合成酶的抑制剂,能抑制乙烯的生物合成,有利于愈伤组织的诱导,提高愈伤组织的质量,有效防治愈伤组织褐化。因此在A培养基中加入不同浓度硝酸银进行抗褐化试验。结果表明,愈伤组织诱导阶段8mg/L硝酸银具有较强的防褐化作用,且作为添加物在一定程度上提高了愈伤组织诱导率,如图1所示。

图1

图1   AgNO3浓度对愈伤组织生长状态的影响

Fig.1   Effects of AgNO3 concentration on callus growth status


2.3 生长素2,4-D对愈伤组织的影响

植物激素被认为是组织培养中愈伤组织细胞分裂、形态分化和再生最重要的生长调节剂[17]。培养基中添加适量的生长素和细胞分裂素对愈伤组织的诱导及分化再生有重要作用。本试验设2,4-D浓度梯度对材料178进行愈伤组织诱导以及再生培养。如图2所示,愈伤组织诱导率在2,4-D浓度6µmol/L时约为38%,在9µmol/L时达到最大为73%,在12和15µmol/L时愈伤组织诱导率急剧下降,分别为38%和32%。对应的再生率也呈现相同的趋势。结果表明诱导培养基中生长素2,4-D的浓度影响了愈伤组织的形成和植株再生,对于材料178进行组织培养比较合适的2,4-D浓度为9µmol/L。

图2

图2   2,4-D浓度对愈伤组织生长状态的影响

Fig.2   Effects of 2,4-D concentration on callus growth status


2.4 细胞分裂素Kinetin对愈伤组织的影响

保持其他成份不变,在培养基A中分别加入2、4、6、8µmol/L Kinetin,对材料178进行愈伤组织诱导以及再生培养。如图3所示,愈伤组织诱导率在Kinetin浓度4µmol/L时最高为72%,在2、6、8µmol/L时分别为52%、43%、32%。在2、4、6、8µmol/L时对应的再生率分别为24%、46%、33%、17%。试验结果表明A培养基中,细胞分裂素Kinetin浓度会影响愈伤组织的数量和质量,对于材料178进行组织培养比较合适的Kinetin浓度为4µmol/L。

图3

图3   Kinetin浓度对愈伤组织生长状态的影响

Fig.3   Effects of Kinetin concentration on callus growth status


2.5 根癌农杆菌的转化条件

2.5.1 菌液浓度 菌液浓度是影响根癌农杆菌转化的关键因素之一。如图4所示,材料178在LBA4404菌液OD600值为0.3~0.5时,获得的抗性愈伤组织率和gus表达率都呈现较好趋势。一般菌液浓度低会导致根癌农杆菌数量不足,达不到感染的目的,菌液浓度过高又会由于营养不足导致菌活力下降从而降低感染效果[18,19],本试验与该结论相符,当OD600值小于0.3或大于0.5时其转化效果都有所下降。

图4

图4   菌液浓度对转化结果的影响

Fig.4   Effects of Agrobacterium concentration on transformation results


2.5.2 侵染时间 以OD600=0.3~0.5的菌液侵染愈伤组织,侵染时间设10、15、20、25、30min 5个处理,侵染15min时,抗性愈伤组织率和gus表达率较高,分别为45.8%和22.8%,侵染20min时,虽然获得的抗性愈伤组织较多、gus表达率也有所提升,但会在愈伤组织的表面及培养基中看到明显的根癌农杆菌菌斑,部分愈伤组织生长受到影响,出现了褐化死亡现象。所以针对材料178根癌农杆菌侵染谷子愈伤组织的适宜时间为15min(图5)。

图5

图5   侵染时间对转化结果的影响

Fig.5   Effects of infection time on transformation results


2.5.3 乙酰丁香酮的浓度 乙酰丁香酮(AS)是双子叶植物细胞壁合成的前体,被广泛用来提高遗传转化率。单子叶植物在转化过程中不能产生足够的酚类物质,难以激活vir基因的感染能力,在转化试验中添加酚类物质可以提高单子叶植物对根癌农杆菌的敏感性[20,21,22]。但是乙酰丁香酮在不同植物种类、不同受体基因型、不同外植体上应用效果不同,必须详细分析。如图6所示乙酰丁香酮浓度在75、100、125μmol/L时,抗性愈伤组织率相对较高,分别为42.6%、43.5%、50.7%;gus表达率也相对较高,分别为24.6%、30.4%、21.5%。综合考虑,针对材料178遗传转化适宜的乙酰丁香酮浓度为100μmol/L。

图6

图6   AS浓度对转化结果的影响

Fig.6   Effects of AS concentration on transformation results


2.6 稳定转化体系及抗性植株的获得

侵染后的愈伤组织经过共培养后,将其转到E培养基上,28℃培养(光强3 000lx,光照16h/d),2周继代1次,分化培养6~7d后,大多数愈伤组织变褐并逐渐死亡,少数愈伤组织状态较好,继续生长,部分愈伤组织的表面会产生绿点,少数绿点可分化成绿芽。待绿芽长到1~2cm后转移到F培养基中,约2周后开始有新根长出,转移至G培养基,待G培养基上植株根较粗壮时,进行炼苗,最后将植株移栽入花盆,温室中生长。每周用Hogland营养液浇2次,得到转化再生的谷子植株。

2.7 转化植株的分子检测

用CTAB法提取谷子叶片基因组DNA,以bar基因为扩增对象。用bar基因特异性引物对转化植株基因组DNA进行扩增。结果如图7所示,转化植株能够扩增出470bp目的条带,表明外源基因已有效整合到谷子基因组DNA中。

图7

图7   谷子转化植株bar基因检测结果

性对照;2:阴性对照;3~11:不同转化株系

Fig.7   The test results of transgenic Setaria italic

Positive control; 2, Negative control; 3-11, Different transformed lines; Marker, DL 5000


3 讨论

基因型是农杆菌介导转化重要的限制因素,其在一定程度上决定了愈伤组织诱导率和愈伤组织的状态。在水稻、玉米、小麦和大麦的组织培养中,适宜的基因型容易进行农杆菌转化[23,24,25,26]。因此,选用不受季节限制、易操作的谷子成熟胚作为外植体,对216份谷子材料进行组织培养和植株再生预试验,筛选适宜谷子转化的受体基因型,最终选用材料178作为受体材料进行农杆菌介导谷子遗传转化体系的建立。基因型通过遗传学特性决定着生化机制及分化再生的进程,因此筛选适宜的谷子基因型仍是谷子遗传转化工作的重点。

影响农杆菌转化的因素复杂多样,包括内在因素(组织培养、再生体系)及外在因素(农杆菌侵染体系),具体来讲涉及到种质基因型、外植体的类型和阶段、愈伤组织诱导条件、根癌农杆菌转化条件以及有效的植株再生程序[27,28,29]。农杆菌转化单子叶禾谷类作物效率低,可能是因为禾谷类不能产生酚类物质或者酚类物质浓度较低难以形成信号。加入外源酚类物质后,转化效率大大提高[28,29]。不同品种的作物转化时所需酚类物质的最适浓度不同。Ceasar等[30]在研究龙爪稷胚性愈伤组织的转化时发现加入100μmol/L乙酰丁香酮转化效率最高;Martins等[31]在建立农杆菌转化狗尾草的简单高效体系中确定加入200μmol/L乙酰丁香酮;Pooja等[32]证明高效转化珍珠粟的关键是加入400μmol/L的乙酰丁香酮。本研究结果表明,侵染培养基中乙酰丁香酮浓度为100μmol/L时转化效果较好。

菌液浓度反应农杆菌的侵染活性,侵染时间决定农杆菌在受体表面的吸附数量,二者共同决定农杆菌的侵染效果。本研究对影响转化的菌液浓度和侵染时间进行了梯度筛选,结果表明菌液OD600值为0.3~0.5侵染15min获得的抗性愈伤组织后期分化速度较快,再生植株生根也明显优于其他条件下的试验结果。另外本研究还对种子处理方法、幼苗移栽、共培养温度、转化前愈伤干燥处理等因素进行了分析,这些试验结果和已有研究[33,34,35]基本一致。本研究针对农杆菌转化中的关键因素进行优化,建立了适合谷子材料178转化的稳定体系,为深入开展谷子遗传转化研究提供参考依据。

目前谷子处于转基因研究的初级阶段,许多重要的外源基因还未能转化到谷子基因组中,因此建立一套高效、标准、规模化的转基因体系非常重要。值得借鉴的是拟南芥的农杆菌蘸花转化法,该方法在拟南芥花期通过蘸花法获得转基因种子,后期将成熟种子在选择培养基上萌发或者对后代植株在苗期喷洒选择剂筛选获得转基因植株[36]。该方法绕过繁琐的植物组织培养环节,加快了转基因进程。谷子某些品种具有拟南芥植株矮小、生育周期短、自花授粉、种子数量多等特点,考虑借鉴拟南芥的农杆菌蘸花转化方法是值得关注的研究方向。可喜的是有报道[37]称狗尾草借鉴拟南芥的蘸花转化法取得成功,这就为研究谷子蘸花转化法提供了技术和理论支持。相信随着科研工作者的不断努力,谷子遗传转化可以像拟南芥遗传转化一样简单、高效、快捷。

The authors have declared that no competing interests exist.
作者已声明无竞争性利益关系。

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谷子是重要的饲草作物, 但其饲草品质性状研究滞后制约了谷子饲草品种培育和栽培。本研究对47个谷子品种在我国高寒农牧地区栽培的饲用干草品质性状进行了系统测定。结果表明, 供试材料粗蛋白含量的变异范围为5.42%~12.45%, 变异系数为14.25;粗脂肪含量的变异范围为0.64%~1.43%, 变异系数为15.84;粗灰分含量的变异范围为8.50%~15.60%, 变异系数为13.71;总磷含量的变异范围为0.10%~0.32%, 变异系数为20.00;总钙含量的变异范围为0.27%~0.67%, 变异系数为20.00。粗纤维、无氮浸出物和水分含量表现出较小的变异。主成分分析表明, 影响谷子饲草品质的主要性状是粗纤维、粗灰分、粗蛋白和无氮浸出物, 粗蛋白与粗纤维和无氮浸出物均为负相关。综合表明, Li05-569、饿死驴、系295和红根谷是品质性状综合表现优良的品种。

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