作物杂志, 2019, 35(5): 196-199 doi: 10.16035/j.issn.1001-7283.2019.05.032

植物保护

甘蔗赤腐病病原菌的分离与ITS序列鉴定

谢林艳1, 狄义宁1, 刘鲁峰1, 吴清莲1, 沈先岳1, 徐荣1, 孟玉1, 何丽莲1,2, 李富生1,2

1 云南农业大学农学与生物技术学院,650201,云南昆明

2 云南农业大学甘蔗研究所,650201云南昆明

Isolation and ITS Sequence Identification of the Pathogen Causing Red Rot Disease on Sugarcane

Xie Linyan1, Di Yining1, Liu Lufeng1, Wu Qinglian1, Shen Xianyue1, Xu Rong1, Meng Yu1, He Lilian1,2, Li Fusheng1,2

1 College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, Yunnan, China

2 Sugarcane Research Institute of Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, Yunnan, China

通讯作者: 何丽莲,高级实验师,主要从事甘蔗资源研究与利用李富生教授,主要从事甘蔗资源研究与利用

收稿日期: 2019-01-9   修回日期: 2019-04-11   网络出版日期: 2019-10-15

基金资助: 福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心开放课题(NERO2018.6.1)
云南省现代农业甘蔗产业技术体系建设专项(2018-2019)

Received: 2019-01-9   Revised: 2019-04-11   Online: 2019-10-15

作者简介 About authors

谢林艳,硕士研究生,研究方向为植物资源评价与利用 。

摘要

从甘蔗赤腐病病原菌分离纯化得到5株病原真菌(CF-1、CF-2、CF-3、CF-4、CF-5),对其进行致病性测定、形态学观察和ITS序列分析。结果表明,CF-1和CF-4均能引起与田间病害一致的症状,通过ITS1和ITS4对致病菌的基因片段进行扩增,结果显示,菌株CF-1与KU933924.1相似性达到99.00%,CF-4与MH854879.1相似性达到99.42%。综合病害症状观察、形态观察和ITS序列分析结果,将甘蔗赤腐病病原菌CF-1鉴定为镰形炭疽菌(Colletotrichum falcatum Went.),将CF-4鉴定为球黑孢菌[Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason.]。

关键词: 甘蔗 ; 赤腐病 ; 病原菌 ; 分离 ; 鉴定

Abstract

Five strains (CF-1, CF-2, CF-3, CF-4, CF-5) of pathogenic fungi were isolated and pathogen by the typical symptomatic tissues of sugarcane red rot with which single spore isolates, morphological observation, pathogenicity test, and ITS molecular sequence analysis were used to identify the pathogen. The results showed that both CF-1 and CF-4 could cause symptoms consistent with those observed in the fields. The amplification of the gene fragments of pathogenic bacteria by ITS1 and ITS4 showed that CF-1 showed 99.00% of identity with KU933924.1 and the strain CF-4 showed 99.42% of identity with MH854879.1. CF-1 was identified as Colletotrichum falcatum Went. and CF-4 as Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason. by culture. shape, morphological observation and ITS sequence analysis.

Keywords: Sugarcane ; Red rot ; Pathogen ; Isolation ; Identification

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本文引用格式

谢林艳, 狄义宁, 刘鲁峰, 吴清莲, 沈先岳, 徐荣, 孟玉, 何丽莲, 李富生. 甘蔗赤腐病病原菌的分离与ITS序列鉴定[J]. 作物杂志, 2019, 35(5): 196-199 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2019.05.032

Xie Linyan, Di Yining, Liu Lufeng, Wu Qinglian, Shen Xianyue, Xu Rong, Meng Yu, He Lilian, Li Fusheng. Isolation and ITS Sequence Identification of the Pathogen Causing Red Rot Disease on Sugarcane[J]. Crops, 2019, 35(5): 196-199 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2019.05.032

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是世界上最重要的糖料作物之一,也是食糖的重要来源之一。

甘蔗种植面积占我国糖料作物种植面积的85%以上,产糖量占食糖总产量的90%以上[1]。近年来,随着蔗糖产业的发展,甘蔗种植过程中产生的病害问题日益突出,甘蔗病害已经成为影响甘蔗产量、制约甘蔗产业稳定发展的主要因素。据调查,世界上已知的甘蔗病害高达160多种[2]

甘蔗赤腐病是世界甘蔗产区普遍发生的真菌性土传病害,是人们最早知道的甘蔗病害之一,1893年在印度尼西亚爪哇首次发现,随后迅速在多个甘蔗生产国发生[3]。据报道,赤腐病是印度、巴基斯坦、美国、孟加拉国和澳大利亚等国家最严重的甘蔗病害之一,对甘蔗造成的产量损失可达25%~50%[4]。甘蔗赤腐病不仅使产量降低,其病原菌还能分泌一种蔗糖转化酶,使植株体内的蔗糖转化为单糖,从而降低蔗汁纯度并减少蔗糖分,造成严重的经济损失[5]。甘蔗赤腐病由半知菌类炭疽菌属镰形炭疽菌(Colletotrichum falcatum Went.)引起,有性阶段为子囊菌门囊孢壳属塔地囊孢壳菌[Physalospora tucumanensis Speg. (=Glomerella tucumanensis)][6]

近年来,有关甘蔗赤腐病的研究,国外大多聚焦于甘蔗赤腐病的为害分布、对甘蔗品质的影响、生防菌的筛选、抗病品种的筛选及诱导抗性等方面[7,8]。我国对甘蔗病害的基础性研究比较薄弱,关于甘蔗赤腐病研究还停留在病害发生和防治阶段[9,10,11]。由于分类系统的复杂性以及病原菌生理小种的多样性,导致在病原菌的判定上存在一定的混淆,加上真菌形态特征易受培养条件和其他因素影响,许多子实体类型很难获得,因此传统分类方法无法满足准确鉴定和分类要求。关于甘蔗赤腐病的地域性生理小种分类也未见报道。真菌核糖体基因转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列能够反映出种属间以及菌株间碱基对差异,已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究[12]

本研究对云南德宏8个具有典型甘蔗赤腐病病斑的病原菌进行分离鉴定,为进一步探索甘蔗赤腐病病原菌分类筛选、生物学活性及适应性药剂防治、制定有效的防治方法提供依据,也为以后甘蔗病害研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2018年9-11月在云南省高校作物种质创新与可持续利用重点试验室进行。供试甘蔗病害样本取自云南省德宏州甘蔗科学研究所(云南省陇川县),供试甘蔗品种分别为柳城05-136、粤糖93-159、YJ2015-14、新台糖22、云瑞15-1095、DH2015-60、DH2016-209和云蔗05-49。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与形态观察 采用常规组织分离法分离病原菌[13]。在超净工作台中将带有病害症状的甘蔗叶片在病健组织相间部位切下长宽约5mm的叶组织,用75%的酒精浸泡20s进行表面消毒,接着将其浸泡于0.2%次氯酸钠中,摇动使其充分接触消毒液,消毒1min,用无菌水冲洗3遍,放置于无菌滤纸上,吸干表面水分,然后将叶组织平放在加有50mg/mL氯霉素的PDA培养基(马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂粉20g,蒸馏水定容至1 000mL)表面,将培养皿倒置,放置于29℃恒温培养箱内培养2~3d。

待菌落长出后,用接种针挑取菌落边缘的菌丝接种于PDA培养基上于28℃恒温培养。产孢后进行单孢纯化、形态特征观察,并根据孢子形态进行鉴定[14]

1.2.2 病原菌致病性鉴定 利用柯赫氏法对分离物进行致病性测定[11]。将分离物在PDA培养基上预培养6d左右。选取健康的甘蔗叶片,用75%的酒精进行表面消毒,用无菌针在叶片表面刺伤形成伤口,将上述分离纯化的分离物打成菌饼倒贴于刺伤处,重复3次。28℃保湿培养,每天观察其发病情况。待叶片发病后,从病部对病原菌进行再分离,观察再分离物是否与原分离物的形态特征一致。

1.2.3 病原菌的rDNA-ITS序列分析 参照OMEGA真菌DNA小量提取说明书进行病原菌基因组DNA的提取。利用通用引物ITS1(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对病原菌基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL,包括DNA模板2μL,ITS1和ITS4各1μL,mix 10μL,ddH2O 6μL。PCR扩增程序为94℃预变性3min,94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸30s进行35个循环后,72℃延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,送上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序结果用BLAST软件进行同源性比对,用MEGA 7.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病害症状

感染赤腐病后,甘蔗叶片主要表现为中脉受害,病斑初期表现为小红点,沿中脉扩展成纺锤形或长条形,条斑边缘呈暗红色或棕黑色,后期条斑中央组织变草黄色至枯白色(封底图Ⅰ)。潮湿条件下病斑上散生褐色或黑色小点,即病菌分生孢子盘。

2.2 病原菌分离和致病性鉴定

从具有典型甘蔗赤腐病病斑的甘蔗叶片中一共分离出5株真菌,编号为CF-1~CF-5。采用针刺法将分离得到的病原菌回接到甘蔗叶片,用打孔器取5mm培养5d的病原菌作为接种体接种于伤口处,28℃保湿培养3d,观察发现CF-1和CF-4发病效果与田间症状最为相似,其中CF-1发病较为严重,将CF-1和CF-4共同接种发病最为严重。从接种发病植株上再分离得到的菌株在PDA培养基上培养,得到的菌株与原接种菌株一致,镜检后观察到其分生孢子与原接种菌株分生孢子一致,表明CF-1和CF-4分离得到的病原菌是甘蔗赤腐病的病原菌(封底图Ⅱ)。

2.3 病原菌形态学观察

CF-1菌株在PDA培养基上菌落圆形,菌丝体白色或灰色。CF-1的分生孢子近镰刀形,单胞,色浅,无隔膜,内含粒状物及油点,常具1个中央大液泡,分生孢子密集时呈粉红色或橙红色,分生孢子长55~65μm。CF-4菌落圆形,网状菌丝体,菌丝体初呈白色后呈白灰色,分生孢子单生,单孢球形或近球形,黑色,表面光滑,直径20~35μm(封底图Ⅱ)。

2.4 病原菌的rDNA-ITS序列分析

用真菌通用引物ITS1/ITS4对致病性菌株CF-1和CF-4进行PCR扩增,扩增产物经测序,CF-1目的片段长度为551bp,CF-4目的片段长度为527bp。将测序结果在NCBI上用BLAST软件进行同源性比对,并利用MEGA 7.0软件构建系统发育树(图1),菌株CF-1与炭疽属(Colletotrichum sp)亲缘关系最近,与Colletotrichum falcatum strain LC03(KU933924.1)属于同一分支,进化距离最近,相似性达到99.00%。CF-4与黑孢菌属(Nigrospora sp)同源性高,与Nigrospora sphaerica strain CBS 167.26(MH854879.1)进化距离最近,相似性达到99.42%。

图1

图1   基于rDNA-ITS序列的菌株CF-1和CF-4系统发育树

Fig.1   Phyologenetic tree of strains CF-1 and CF-4 based on rDNA-ITS sequence


结合上述病原菌的形态特征以及rDNA-ITS序列同源性比对结果,将菌株CF-1鉴定为镰形炭疽菌(Colletotrichum falcatum Went),将CF-4菌株鉴定为球黑孢菌[Nigrospora sphaerica (Sacc.) E. W. Mason.]。

3 讨论

我国蔗糖产量、食糖消费量已经跃居世界的第3位,甘蔗主产区广西的甘蔗单产已超过世界甘蔗单产平均水平,为世界第二大蔗区,我国蔗糖生产在世界上具有举足轻重的地位。长期以来,我国甘蔗生产以连作为主,近年来蔗区气候异常、高湿多雨及虫害严重,为甘蔗赤腐病的发生流行提供了条件,部分蔗区突发甘蔗赤腐病,严重影响甘蔗的产量和品质[15]。目前,对甘蔗病害的防治主要以化学防治为主。甘蔗是我国重要的糖料作物,在栽培过程中应尽可能减少化肥和农药的使用。长期以来甘蔗赤腐病是我国蔗区一种次要病害,关于甘蔗赤腐病害的基础性研究不多,但近年甘蔗茎赤腐病局部发生严重,经济损失较重[16]。甘蔗赤腐病菌存在多种致病型,且致病机理错综复杂,只有理解了甘蔗赤腐病病原菌的致病机理,才能更好地指导抗病育种。

甘蔗赤腐病由半知菌类炭疽菌属镰形炭疽菌引起,有性阶段为子囊菌门囊孢壳属塔地囊孢壳菌[6]。本研究除了分离到甘蔗赤腐病的致病菌镰形炭疽菌外,还分离到一株球黑孢菌,该菌也能引起甘蔗赤腐病。本研究分离的球黑孢菌在甘蔗叶脉赤腐病上首次发现。球黑孢菌为半知菌类丛梗孢目暗梗孢科黑孢霉属,黑孢霉属是由Zimmermann于1902建立的,这个属的真菌广泛分布在土壤、腐烂的植物和种子上[17]。球黑孢菌寄主范围广泛,在小麦、燕麦、玉米、芝麻、茶叶、火龙果和猕猴桃等多种植物上均能引起发病[18,19,20]。Cui等[21]对广东蔗区的调查发现,球黑孢菌能引起甘蔗叶枯病。

本研究对甘蔗赤腐病病原菌进行了鉴定,旨为今后甘蔗赤腐病的防治、抗病种质筛选、抗病转基因以及抗病育种等的研究提供理论依据和指导。

4 结论

采用组织分离法对甘蔗赤腐病病原菌进行分离、纯化,得到5株菌株,通过致病性鉴定发现,在分离到的5株菌株中,除了CF-1能引起发病外,CF-4菌株也能致病,并且8个样本中均分离出CF-4菌株。通过致病性鉴定发现,CF-1和CF-4发病效果与田间发病症状一致,对回接叶片的分离物进行镜检观察,仍然得到形态一致的菌株。试验还进行了复合接种,将CF-1和CF-4共同接种后发现叶片发病更为严重,从复合接种的菌株分离到CF-1和CF-4两株致病菌。通过ITS序列鉴定将CF-1鉴定为镰形炭疽菌,将CF-4菌株鉴定为球黑孢菌。

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通过1年来对海南甘蔗产区8个县(市)28个乡镇进行病害调查,初步明确了海南甘蔗病害种类。共发现病害31种,其中由病原真菌引起的病害有19种,由病原细菌引起的病害有3种,由病毒引起的病害2种和由线虫引起的病害3种及由于甘蔗生长期出现的缺氮、缺磷、缺钾、缺钙等生理性病害4种。在这些病害中,甘蔗黑穗病(Ustilago scitaminea Sydow.)、赤腐病(Colletotrichum fuleatum Went.)、黄斑病(Mycovellosiella koepkei(Kruger)Deighton.)、轮斑病(Leptosphaeria sacchari Breda de Haan)、梢腐病(Gibberella fujikuroi(Sawada) Wollenw)、宿根矮化病(Clavibacter xyli subsp. xyli Davis )和甘蔗黄叶病(Sugarcane yellow-leaf virus, SCYLV)、花叶病(Sugarcane mosaic virus,SCMV)最为普遍,而对甘蔗生产产生主要影响的是甘蔗黑穗病和甘蔗花叶病。总结甘蔗苗期、生长中期及后期发生的各类主要病害,对指导海南蔗区甘蔗生产具有重要的意义。

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