水稻中4种蛋白质均溶解于稀碱溶液,但在提取蛋白质时,会有部分淀粉糊化产生淀粉层,不利于蛋白质的提取,且提取率偏低,试验误差大。由于淀粉难溶于乙醇,故试验中在70%乙醇水溶液中加入0.3%质量体积分数的NaOH,蛋白质提取效率得到提高,同时淀粉糊化层明显消失,便于提取液离心时与固相分离。本试验在此基础上针对提取试验因素进行正交优化设计,筛选最优提取试验方案。采用70%乙醇水溶液提取醇溶蛋白后,残渣采用优化的试验方法提取剩余蛋白质。测定水稻中可消化蛋白质含量,为水稻高营养育种提供技术支撑及育种材料。
1 材料与方法
1.1 供试材料
从国际水稻研究所（International Rice Research Institute,IRRI）引进804份水稻材料,地理来源见图1。其中亚洲材料最多,其次是非洲、南美洲、欧洲、北美洲及大洋洲,大洋洲材料仅3份。
图1
图1
国际水稻研究所引进水稻资源地理来源统计
Fig.1
Statistics of geographical sources of imported rice resources of International Rice Research Institute
1.2 主要仪器与试剂
RADWAG AS 220.R2万分之一天平、9240A电热鼓风干燥箱、PALL casacada 3.1超纯水机、UV-3100 MAPADA分光光度计、GT-SONIC P9超声清洗器、WH-3微型旋涡混合仪、FS2型实验室旋风式粉碎磨、FC2K糙米机、VP-32T试验用精米机、centrifuge 5804R Eppendorf高速冷冻离心机。
NaOH（分析纯,以下简称A.R）、H3PO4（A.R）、无水乙醇（A.R）、牛血清蛋白标准品（纯度98%）、考马斯亮蓝G250。
1.3 试验设计
试验材料于2017年种植于江苏省连云港市农业科学院东辛试验基地,2018年于连云港市农业科学院水稻品质分析实验室测定蛋白质含量等品质性状。
表1 正交试验因素水平
Table 1
| 碱浓度(%) Alkali concentration | 乙醇浓度(%) Ethanol concentration | 固液比 Solid liquid ratio | 超声时间(min) Ultrasonic time |
|---|---|---|---|
| 0.25 | 30 | 1g:10mL | 30 |
| 0.30 | 40 | 1g:15mL | 40 |
| 0.35 | 50 | 1g:20mL | 50 |
| 0.40 | 60 | 1g:25mL | 60 |
表2 正交试验方案
Table 2
| 处理 Treatment | 碱浓度(%) Alkali concentration | 乙醇浓度(%) Ethanol concentration | 固液比 Solid liquid ratio | 超声时间(min) Ultrasonic time |
|---|---|---|---|---|
| T1 | 0.25 | 30 | 1g:10mL | 30 |
| T2 | 0.25 | 40 | 1g:15mL | 40 |
| T3 | 0.25 | 50 | 1g:20mL | 50 |
| T4 | 0.25 | 60 | 1g:25mL | 60 |
| T5 | 0.30 | 30 | 1g:20mL | 60 |
| T6 | 0.30 | 40 | 1g:25mL | 50 |
| T7 | 0.30 | 50 | 1g:10mL | 40 |
| T8 | 0.30 | 60 | 1g:15mL | 30 |
| T9 | 0.35 | 30 | 1g:25mL | 40 |
| T10 | 0.35 | 40 | 1g:20mL | 30 |
| T11 | 0.35 | 50 | 1g:15mL | 60 |
| T12 | 0.35 | 60 | 1g:10mL | 50 |
| T13 | 0.40 | 30 | 1g:15mL | 50 |
| T14 | 0.40 | 40 | 1g:10mL | 60 |
| T15 | 0.40 | 50 | 1g:25mL | 30 |
| T16 | 0.40 | 60 | 1g:20mL | 40 |
| T17 (CK) | 0.30 | 70 | 1g:15mL | 30 |
1.4 考马斯亮蓝G250染色试剂配制方法
称取200mg考马斯亮蓝G250置于100mL烧杯中,以量筒量取100mL 95%乙醇水溶液,分3次倒入烧杯中,溶解考马斯亮蓝G250,每次以95%乙醇溶解后,转移到2 000mL容量瓶中,用纯水洗涤烧杯,一并转入容量瓶,再以200mL量筒量取200mL 85% H3PO4,倒入容量瓶,将200mL量筒以纯水冲洗,洗涤液一并转入容量瓶,混匀定容后倒入棕色试剂瓶备用。
考马斯亮蓝G250染色试剂在室温下存放不超过1个月,4℃下存放不超过6个月。
1.5 可消化蛋白质测定
样品准备:将测试样收获后室内水分平衡3个月,经测试平衡水分含量14.5%。试样出糙后磨成粉装入密封袋供测定。
可消化蛋白质提取:将70.0mg过80目筛的糙米粉和体积比浓度70%的乙醇水溶液按固液比1g:15mL充分混合,超声波提取3次,每次于50℃、功率300W条件下超声波提取40min;每次超声波提取后,置离心机中,每分钟转数10 000次离心10min,弃上清液。
残渣与提取试剂（在体积比浓度60%乙醇水溶液中,加入质量体积比浓度0.40%的NaOH）按固液比1g:15mL充分混合,超声波提取3次,每次于50℃、功率300W条件下超声波提取40min;每次超声波提取后,置离心机中,每分钟转数10 000次,离心10min得上清液,倒入相应容量瓶中,采用定容试剂（质量体积比浓度0.40% NaOH水溶液）定容到25mL,充分混匀,得到可消化蛋白质提取液;以房列涛等[7]方法测定可消化蛋白质含量。
1.6 统计分析
采用Excel 2010进行数据的基本统计与分析,采用陈庭木等[8]方法进行相关分析、偏相关分析及通径分析。采用Ward方法进行系统聚类,采用单因素重复观察模型进行方差分析,系统聚类与方差分析均调用连云港市农业科学院编写的C++类库（软件著作权《连农统计类库软件V1.0》编号:2016SR266205）。数据交换接口采用DSML C++类库（软件著作权《连农DSML文件读写程序软件V1.0》编号:2017SR562716）,最后编写C++主程序以VS.NET2010编译生成可执行程序并执行运算。
2 结果与分析
2.1 蛋白质含量测定的线性关系
以牛血清蛋白标准品（bovine serum albumin,BSA）为蛋白质标准样,测定反应体系600nm与465nm波长吸光度,分别以A600、A465表示。反应体系中蛋白质含量（x）与A600/A465吸光度比值（y）间呈线性关系（图2）,回归曲线决定系数R2=0.9999,回归方程极显著。
图2
2.2 正交优化试验
不同试验方案提取液蛋白质含量方差分析F值为56.8,无差别概率P=2e-16,达极显著水平（表3,SSR法）,结果表明:提取液蛋白质含量T16最高,即碱浓度0.40%、乙醇浓度60%、固液比1g:20mL、超声时间40min处理方法在本次蛋白质提取方案优化正交试验中是最优方案。
表3 蛋白质提取正交试验结果
Table 3
| 处理 Treatment | 重复Repeat | 平均 Average | ||
|---|---|---|---|---|
| Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | ||
| T1 | 2.7381 | 2.9181 | 2.6652 | 2.7738g |
| T2 | 3.8575 | 4.1175 | 4.1009 | 4.0253cd |
| T3 | 4.5201 | 4.0480 | 4.5995 | 4.3892abc |
| T4 | 4.1211 | 4.0053 | 4.3273 | 4.1512bcd |
| T5 | 1.9880 | 1.9904 | 1.7808 | 1.9197h |
| T6 | 3.8264 | 3.8296 | 4.1371 | 3.931de |
| T7 | 4.3076 | 4.0519 | 4.6434 | 4.3343bcd |
| T8 | 3.2721 | 3.7520 | 3.7740 | 3.5994ef |
| T9 | 1.7408 | 1.5948 | 1.8809 | 1.7388h |
| T10 | 3.2347 | 3.2947 | 3.6159 | 3.3818f |
| T11 | 3.9750 | 4.6421 | 4.8588 | 4.492ab |
| T12 | 4.3465 | 4.4786 | 4.5657 | 4.4636ab |
| T13 | 1.9913 | 1.9704 | 1.8209 | 1.9275h |
| T14 | 4.6533 | 4.0477 | 4.0604 | 4.2538bcd |
| T15 | 4.5498 | 4.1563 | 4.1454 | 4.2838bcd |
| T16 | 4.7898 | 4.6145 | 4.9990 | 4.8011a |
| T17(CK) | 2.9284 | 2.7422 | 2.5562 | 2.7423g |
Note: Different small letters indicate significant difference (P<0.05), the same below
注:不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）,下同
正交试验提取液蛋白质含量方差分析（表4）表明,乙醇浓度F值（118.7114）远高于其他因素,在蛋白质提取试剂配方中为首要改良因素,其次为固液比与碱浓度。不同乙醇浓度间、不同固液比间提取液蛋白质含量差异极显著,不同碱浓度间提取液蛋白质含量差异显著,超声时间效应不显著。
表4 蛋白质提取正交试验方差分析
Table 4
| 变异来源 Source of variation | 变异平方和 Sum of squares of variation | 变异自由度 Variation degree of freedom | 变异均方 Variance mean square | F | P |
|---|---|---|---|---|---|
| 碱浓度Alkali concentration | 1.4469 | 3 | 0.4823 | 4.2284 | 0.0119 |
| 乙醇浓度Ethanol concentration | 40.6212 | 3 | 13.5404 | 118.7114 | 0.0000 |
| 固液比Solid liquid ratio | 1.5499 | 3 | 0.5166 | 4.5294 | 0.0087 |
| 超声时间Ultrasonic time | 0.3472 | 3 | 0.1157 | 1.0147 | 0.3979 |
| 误差Error | 3.9921 | 35 | 0.1141 |
表5各因素内水平之间多重比较结果基本与当前最优方案相同。
表5 蛋白质提取正交试验的多重比较
Table 5
| 碱浓度(%) Alkali concentration | 蛋白质含量(%) Protein content | 乙醇浓度(%) Ethanol concentration | 蛋白质含量(%) Protein content | 固液比 Solid liquid ratio | 蛋白质含量(%) Protein content |
|---|---|---|---|---|---|
| 0.25 | 3.8349aA | 50 | 4.3748aA | 1g:15mL | 3.9563aA |
| 0.40 | 3.8166aA | 60 | 4.2538aA | 1g:15mL | 3.6229abA |
| 0.35 | 3.5191abA | 40 | 3.8980bA | 1g:15mL | 3.5262bA |
| 0.30 | 3.4461bA | 30 | 2.0900cB | 1g:15mL | 3.5110bA |
Note: Different capital letters indicate between treatments extremely significant difference (P<0.01)
注:不同大写字母表示处理间差异极显著（P<0.01）
针对乙醇浓度与固液比作深入试验,将原最优方案T16改进设计成3种新方案T18、T19、T20,将固液比均调整为1g:15mL,乙醇浓度分别设计为50%、55%、60%,其他因素保持T16的水平。对提取液蛋白质含量作方差分析与多重比较（表6,LSD法）,T19提取液蛋白质含量显著低于T20,另外2种乙醇浓度与原最优方案提取液蛋白质含量差异不显著,但T20提取液蛋白质含量略优于原最优方案T16。考虑试验方便,将原最优方案再次优化为碱浓度0.40%、乙醇浓度60%、固液比1g:15mL、超声时间40min。
表6 蛋白质提取正交试验的再优化
Table 6
| 试验号 Test number | 碱浓度(%) Alkali concentration | 乙醇浓度(%) Ethanol concentration | 超声时间(min) Ultrasonic time | 固液比 Solid liquid ratio | 蛋白质含量(%) Protein content |
|---|---|---|---|---|---|
| T20 | 0.40 | 60 | 40 | 1g:15mL | 4.5953a |
| T16 | 0.40 | 60 | 40 | 1g:20mL | 4.5260ab |
| T18 | 0.40 | 55 | 40 | 1g:15mL | 4.4167ab |
| T19 | 0.40 | 50 | 40 | 1g:15mL | 4.3001b |
2.3 可消化蛋白质含量的测定结果
804份水稻材料依据1.5方法测定可消化蛋白质含量,最小值为4.16%,最大值16.44%,极差12.28%,平均7.80%,变异系数19.29%。依据系统聚类法中Ward法作聚类分析,对每一种聚类方案均作单因素重复试验方差分析。数据表明可将所有材料分为5个类群。其中以中低可消化蛋白质含量类群样本数量最多,其次为中等可消化蛋白质含量类群（图3）。高可消化蛋白质含量样本仅1例,另两类样本均较少。可见水稻可消化蛋白质含量分布多集中于6.3%~9.3%。引进材料高与较高可消化蛋白质含量材料有（全部引用IRRI标准资源代号,下同）GERVEX 138-C1、IRGC 61667-1、IRGC 45255-1、IRGC 10793-1、IRGC 67958-1、IRGC 67958-1、IRGC 67968-1、IRGC 63619-1、IRGC 63772-1、IRGC 81603-1、IRGC 63796-1、IRGC 34259-1、IRGC 50649-1、IRGC 7756-1、IRGC 38899-1、IRGC 49127-2、IRGC 72148-1。低可消化蛋白质含量资源有IRGC 73124-1、IRGC 3272-1、IRGC 68951-1、IRGC 69015-1、IRGC 78342-1、IRGC 21082-1、IRGC 22401-1、IRGC 29333-1、IRGC 27403-1、IRGC 34967-1。
图3
图3
不同可消化蛋白质含量水稻类群可消化蛋白质含量及频数
不同大小写字母表示在0.01和0.05水平下差异极显著或显著
Fig.3
Digestible protein content and frequency of rice groups with different digestible protein contents
Different capital and lowercase letters indicate extremely significant and significant difference at the 0.01 and 0.05 level, respectively
3 讨论
3.1 可消化蛋白质含量测定方法选择
传统方法提取蛋白质多采取细胞裂解液,细胞裂解液中有还原剂、去污剂及含氮成分的尿素,提取液适合蛋白质电泳,因含有含氮的尿素,不适用凯氏定氮法测定,因含有还原剂不适合2,2′-联喹啉-4,4′-二羧酸法（BCA法）测定,因含有去污剂不适合考马斯亮蓝法测定。传统的Osborne方法[2,3,4]采用稀碱液提取蛋白质存在淀粉糊化产生糊精层干扰,不能将离心后液体完全与固态残渣分离,不利于蛋白质的完全提取,且试验操作中要搅拌助溶,工作量大且易造成误差。本研究蛋白质提取试剂配方在保证基本完全提取的前提下,提取物仅含有乙醇与NaOH,适用于更多方法用于蛋白质含量定量分析,且试验操作相对简单,试验误差较小。蛋白质提取后可以采用多种方法[9]测定,包括为凯氏定氮法、Lowry法、双缩脲法、2,2′-联喹啉-4,4′-二羧酸法（BCA法）、考马斯亮蓝法及紫外-可见分光光度法。本研究采用考马斯亮蓝法,在蛋白质完全溶出提取后,染色测定在10min内能完成,但采用不同种类蛋白质标准品,测定结果有差异,克服此缺点可应用对标准品不敏感的BCA法（试剂价格高,操作时间较长）。目前蛋白质含量测定方法中准确性最高、重复性最好的仍是凯氏定氮法,但工作效率低。对水稻蛋白质含量的资源筛选及育种选择,考虑到仪器价值、试验费用及测定速度,应用考马斯亮蓝法更优。
3.2 水稻蛋白质含量选择及遗传表现
前人[10,11,12,13,14]研究表明,随着蛋白质含量的提高,水稻食味值在一定程度上呈下降趋势,但蛋白质含量低至一定程度后再下降则不能提高食味值[13]。徐大勇[15]研究认为随着N肥增加,稻谷氨基酸总量与总蛋白质含量均提高;王晓波等[16]研究表明,水稻高氮、高磷有利于籽粒蛋白质含量的提高,刘保国等[17]研究认为抽穗期施氮会提高稻谷蛋白质含量。相对于环境与栽培条件,遗传改良虽然复杂,但应用成本更低。陈能等[18]研究了5 323份水稻样品,籼稻蛋白质含量普遍高于粳稻,且大部分品种蛋白质含量在8%~11%,高蛋白质与低蛋白质含量水稻品种均不足供试品种总数的15%。如果水稻胚部增大,会增大籽粒蛋白质含量[19]。选育高蛋白质含量品种应采用籼型大胚技术路线,而选育低蛋白质含量品种应采用粳型正常胚技术路线。
3.3 高可消化蛋白质含量水稻材料的利用
稻谷蛋白质含量主要反映水稻的营养价值高低,但蛋白质含量偏高会对大米的适口性造成显著负面影响[10,11,12,13,14],高可消化蛋白质育种多用于米粉稻及饲料稻育种。除极个别谷蛋白突变体外,醇溶蛋白含量较低,蛋白质含量与可消化蛋白质含量间存在极显著相关关系。蛋白质含量遗传呈典型的数量遗传,为微效基因,育种成效小,水稻高蛋白质含量育种主要依靠蛋白质含量的表型测定选择。Heda等[20]与黎用朝等[21]研究认为高蛋白质含量与高产之间无本质矛盾,高蛋白质品种同样可实现高产。但无论用什么方法,使用高蛋白质含量的资源至关重要。本试验筛选到17份高或较高可消化蛋白质含量的水稻材料,可作为育种资源利用。
3.4 低可消化蛋白质含量水稻材料的利用
晚期糖尿病人及肾脏病人对蛋白质摄入量有严格限制,要求水稻谷蛋白含量小于4%。对谷蛋白测定相对于可消化蛋白测定要复杂得多,以可消化蛋白含量来衡量水稻蛋白质含量更科学,因为清蛋白与球蛋白也是人体可消化的蛋白质,应当与谷蛋白含量一并考虑,同时简化了测定方法。考虑到清蛋白与球蛋白合计含量平均约占糙米的1%左右,故将肾脏病人的可消化蛋白质含量限制在5%以下较为合理。
另在酿酒行业,对稻米蛋白质含量的要求也较高,稻米蛋白质含量低才能保证花雕酒与日本清酒的品质。一般水稻中醇溶蛋白质含量不到1%,除了谷蛋白含量突变体材料外,一般醇溶蛋白对水稻品种蛋白质含量的影响很小。
4 结论
在60%乙醇水溶液中加入0.40%质量体积分数的NaOH作为提取溶剂,以固液比1g:15mL向定量称取糙米粉（过80目筛）中加入提取溶剂,充分混匀,采用300W超声波重复提取3次可以将水稻糙米中的蛋白质完全提取,如将糙米中醇溶蛋白质完全提取并离心,残渣再用上述方法提取,则所提取蛋白质为可消化蛋白质。本研究对引自国际水稻所的804份水稻资源的糙米粉测定可消化蛋白质含量,筛选到1份高可消化蛋白质含量资源、16份较高可消化蛋白质含量资源及11份低可消化蛋白质含量的资源。
