作物杂志, 2020, 36(3): 79-84 doi: 10.16035/j.issn.1001-7283.2020.03.013

遗传育种·种质资源·生物技术

马铃薯纺锤块茎类病毒RT-qPCR检测技术体系的建立

邱彩玲1, 范国权1, 申宇1, 高艳玲1, 张威1, 韩树鑫2, 张抒1, 董学志1, 马纪1, 白艳菊,1

1黑龙江省农业科学院马铃薯研究所/农业农村部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心(哈尔滨),150086,黑龙江哈尔滨

2黑龙江省农垦科学院植物保护研究所,150000,黑龙江哈尔滨

Establishment of RT-qPCR Detection System for Potato Spindle Tuber Viroid

Qiu Cailing1, Fan Guoquan1, Shen Yu1, Gao Yanling1, Zhang Wei1, Han Shuxin2, Zhang Shu1, Dong Xuezhi1, Ma Ji1, Bai Yanju,1

1Potato Research Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences/Supervision and Testing Center for Virus-Free Seed Potatoes Quality of Ministry of Agriculture and Rural Affairs (Harbin), Harbin 150086, Heilongjiang, China

2Plant Protection Research Institure of Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences, Harbin 150000, Heilongjiang, China

通讯作者: 白艳菊,主要从事马铃薯种薯质量检测体系和马铃薯病毒研究,E-mail: yanjubai@163.com

收稿日期: 2019-11-21   修回日期: 2020-03-1   网络出版日期: 2020-06-15

基金资助: 黑龙江省农业科学院科研项目(2019JJPY013)
黑龙江省农业科学院科研项目(2019CGJL004)
黑龙江马铃薯产业技术协同创新推广体系

Received: 2019-11-21   Revised: 2020-03-1   Online: 2020-06-15

作者简介 About authors

邱彩玲,主要从事马铃薯纺锤块茎类病毒及种薯质量控制技术研究,E-mail:279145673@qq.com 。

摘要

马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)是马铃薯生产中的一种重要病害,目前主要通过使用脱毒种薯及隔离措施来防控,探索高效、灵敏、特异性强的检测技术对于防治该病害具有重要意义。设计了3组引物,1条探针,从3组引物中筛选出最优组合,并以他们为引物,以PSTV 251T为探针,利用5′FAM、3′TAMRA标记,建立了PSTVd的RT-qPCR检测技术体系。利用该检测体系成功地检测了22份马铃薯样本。与灵敏度相对较高的RT-PCR技术相比,该检测技术体系的检测灵敏度又提升了100~1 000倍。

关键词: 马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd) ; RT-qPCR ; 检测技术

Abstract

Potato spindle tuber viroid (PSTVd) is an important disease in potato production. The disease currently relies mainly on the use of virus-free seed potatoes and isolation measures to control. For PSTVd control, it is very important to explore a detection technology with high efficiency, sensitivity and specificity. In this study, three pairs of primers and one probe were designed and the optimal combination was selected from them. By use of these primer pairs and the probe PSTV 251T, marked with 5'FAM and 3'TAMRA, a PSTVd RT-qPCR detection system was established and 22 potato samples were tested successfully using this system. Compared with the RT-PCR technology with relatively high sensitivity, the sensitivity of this RT-qPCR system was increased 100-1 000 times.

Keywords: Potato spindle tuber viroid (PSTVd) ; RT-qPCR ; Detection technology

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本文引用格式

邱彩玲, 范国权, 申宇, 高艳玲, 张威, 韩树鑫, 张抒, 董学志, 马纪, 白艳菊. 马铃薯纺锤块茎类病毒RT-qPCR检测技术体系的建立[J]. 作物杂志, 2020, 36(3): 79-84 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2020.03.013

Qiu Cailing, Fan Guoquan, Shen Yu, Gao Yanling, Zhang Wei, Han Shuxin, Zhang Shu, Dong Xuezhi, Ma Ji, Bai Yanju. Establishment of RT-qPCR Detection System for Potato Spindle Tuber Viroid[J]. Crops, 2020, 36(3): 79-84 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2020.03.013

马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTVd)不仅影响马铃薯产量,还导致其品质下降,是马铃薯生产中的一种重要病害。该病害于1922年发现,但由于该病害与其他病害差异较大,直到1971年才被成功分离[1]。PSTVd曾在世界上很多国家或地区发生,并对马铃薯生产造成了一定的影响[2,3,4]。该病害在中国也普遍发生[5],而且马铃薯种质资源和育种材料带毒率非常高,给马铃薯常规育种工作的开展带来了极大的阻碍。PSTVd侵染马铃薯的症状因品种、环境以及病原的致病性或株系而异,通常可引起植株矮化,块茎变小、变长和畸形等,减产幅度为10%~50%。由于PSTVd很难通过茎尖分生组织培养来脱除,因此,目前生产上主要以使用无毒种薯的方法来防控。在PSTVd的防控工作中,应选用特异性强、灵敏度高、操作简便的检测技术。

目前,PSTVd的主要检测方法有生物学检测、电子显微镜、往返电泳(return-polyacrylamidegel electrophoresis,R-PAGE)、逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、核酸斑点杂交(nucleic acid spot hybridization,NASH)、小RNA高通量测序和实时荧光定量PCR(reverse transcription-real time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)检测等。在上述方法中,生物学检测技术是检测PSTVd最基本、最早的方法,利用该技术还可鉴定PSTVd株系致病性的强弱,但该技术检测周期长,受环境影响大。电子显微镜法具有快速、简单和直接等优点,但需要专业电镜操作技能,且电子显微镜体积大,需要专门的实验室安放,价格昂贵,一般的实验室都不具备该设备。R-PAGE法克服了检测周期长,受环境影响大等缺点,但存在着检测灵敏度偏低和一次性检测样品量小等缺点。RT-PCR法检测灵敏度高,周期短,但存在易受试剂、引物和环境等污染而出现假阳性的弊端。NASH法一次性检测样品量大,但灵敏度低于RT-PCR,且探针制备繁琐。小RNA高通量测序技术理论上可以一次性检测出所有已知、未知的病毒和类病毒,但该方法目前的检测成本高、周期长,不适合日常检测。RT-qPCR法将PCR与荧光检测方法相结合,具有特异性强、灵敏度高、可定量、自动化程度高、全程闭管操作和不易交叉污染等优点,在各领域得到广泛应用[6,7,8]。由于RT-qPCR检测技术能够定量分析,因此,该技术体系的建立对PSTVd致病机理研究等方面也具有重要意义。

本研究旨在为PSTVd建立一套检测灵敏度高、特异性强的RT-qPCR检测技术体系,为PSTVd日常检测、育种材料筛选和科学研究提供技术支持。

1 材料设备与试验方法

1.1 试验材料

试验材料来自黑龙江、吉林、内蒙古、山东和陕西等省份感染PSTVd的马铃薯试管苗和休眠块茎以及未感染PSTVd的马铃薯材料,共22份(表1)。

表1   马铃薯样品来源

Table 1  The sources of potato samples

样品编号
No. of sample
样品来源
Source of sample
样品类型
Sample type
PSTVd
(NASH)
1黑龙江试管苗+
2黑龙江试管苗+
3黑龙江试管苗+
4吉林试管苗+
5内蒙古试管苗-
6黑龙江试管苗+
7吉林试管苗+
8黑龙江休眠块茎+
9内蒙古试管苗-
10山东试管苗+
11内蒙古试管苗-
12内蒙古试管苗-
13山东休眠块茎+
14内蒙古试管苗-
15内蒙古试管苗+
16内蒙古试管苗-
17内蒙古试管苗-
18内蒙古试管苗-
19黑龙江休眠块茎+
20陕西试管苗+
21吉林试管苗+
22内蒙古试管苗+

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1.2 试验试剂与仪器

RNA提取试剂盒及DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)购自天根生化科技(北京)有限公司;高纯度质粒小量快速提取试剂盒和无DNA酶、RNA酶的水购自北京原平皓生物技术有限公司;引物及探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;反转录试剂盒、PCR试剂盒以及pMD18-T载体均为宝生物工程(大连)有限公司生产;感受态细胞为北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司生产的大肠杆菌DH5α;Real-time PCR试剂盒为罗氏诊断产品(上海)有限公司生产,其他常规试剂均为分析纯。

主要试验仪器有微量紫外分光光度计、PCR仪和Real-time PCR仪。

1.3 试验方法

1.3.1 RNA提取及反转录 利用Trizol试剂提取马铃薯块茎和试管苗RNA,最后用RNAse-free水溶解RNA,用ND-1000测定RNA溶液的质量和浓度,-20℃保存备用。

使用宝生物工程(大连)有限公司生产的反转录试剂盒进行反转录。

1.3.2 引物及探针的设计及合成 参考Boonham等[9]的方法,同时通过网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/查找PSTVd的序列,根据其保守序列,以PSTVd(AF483471)为参考序列设计特异性引物和Taqman探针(表2)。

表2   引物及探针设计

Table 2  Design of primers and probes

引物/探针
Primer/Probe
方向
Direction
序列 (5′-3′)
Sequence (5′-3′)
备注
Note
反应体系及程序
Reaction system and procedure
PSTV 231F正向引物GCCCCCTTTGCGCTGT参考Boonham等[9]反应体系(10μL): 引物1(10μmol/L)1μL+引物2(10μmol/L)1μL+探针(10μmol/L)0.4μL+Master Mix(2×)10μL+PCR Grade H2O 5.6mL+质粒/cDNA 2μL
反应程序: 95℃ 10 min,1个循环;95℃ 10s,55℃ 50s,72℃ 1s,45个循环
PSTV 296R反向引物AAGCGGTTCTCGGGAGCTT
PSTV 234F正向引物CCCTTTGCGCTGTCGCTT
PSTV 350R反向引物TGCGGTTCCAAGGGCTAA
PSTV 356R反向引物ACCAACTGCGGTTCCAAG正向引物也使用PSTV 234F
PSTV 251T探针CAGTTGTTTCCACCGGGTAGT5′FAM,3′TAMRA,3对引物均用此探针

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1.3.3 标准品制备 采用农业行业标准NY/T 1962-2010——《马铃薯纺锤块茎类病毒检测》中规定的RT-PCR法扩增目的片段。在紫外灯下切下目的片段后,利用离心柱型琼脂糖凝胶回收试剂盒对包含目的片段的凝胶进行回收和纯化。经过溶解、吸附和漂洗后,用EB将目的片段洗脱,于1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

目的片段的连接及转化: 连接反应在1.5mL Eppendorf管内进行,反应体系参见pMD18-T Vector说明书,于4℃条件下连接过夜。

转化: 首先将感受态细胞冰浴,然后热激、复苏,再将已转化的感受态细胞加到含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中,涂板,37℃过夜倒置培养,以未经转化的大肠杆菌感受态细胞作为对照。

阳性菌落PCR鉴定观察过夜培养的菌落,选取单菌落涂板培养,将培养后得到的菌落进行PCR鉴定。

采用NY/T 1962-2010——《马铃薯纺锤块茎类病毒检测》中规定的RT-PCR法进行鉴定,将其中的cDNA更换为从平板挑取的单菌落。本试验选取3个PSTVd阳性样品,每个样品挑取6个单菌落涂板培养后进行菌落的PCR鉴定。

对鉴定为阳性的菌落使用“高纯度质粒小量快速提取试剂盒”进行重组质粒的提取,最后用紫外分光光度计ND-1000测定质粒浓度,-20℃保存。

重组质粒序列由生工生物工程(上海)股份有限公司测序,采用BioEdit软件和Blast进行序列分析。

1.3.4 qPCR标准曲线的建立及引物的筛选 重组质粒拷贝数的计算公式: 6.02×1023×样品浓度(ng/μL×10-9)/DNA长度×660,其中6.02×1023为阿佛加德罗常数。本研究中使用的是pMD18-T载体,其碱基对数为2 964,经测定本研究使用的重组质粒的初始浓度为101.17ng/μL,因此,本试验中所使用的质粒初始浓度拷贝数为: (6.02×1023)×101.17ng/μL×10-9/2964×660=3.11×1010拷贝/μL。

将重组质粒做连续梯度稀释,制备标准品,方法如下: 分别吸取27μL无酶水于11个200μL的PCR管中,分别标记为1、2、3……11,吸取重组质粒原液3μL加入到管1中,充分混匀后,从中吸取3μL加入到管2中,以此类推,得11个浓度梯度。原液及梯度溶液浓度分别为101.17ng/μL~1.0117ag/μL(3.11×1010~3.11×10-1拷贝/μL)。

引物及探针的比较和筛选: 以原液及前5个稀释的质粒DNA溶液为模板,使用Roche LightCycler®480荧光定量PCR仪对3组引物(PSTV 231F,PSTV 296R;PSTV 234F,PSTV 350R;PSTV 234F,PSTV 356R)以及探针PSTV 251T进行Real-time PCR扩增,每个样品重复3次,建立3个体系的标准曲线,反应体系及反应程序见表2

1.3.5 检测灵敏度分析 对选出的RT-qPCR体系进行灵敏度测试,利用浓度较低的标准品制备标准曲线,各标准品的浓度分别为3.11×107~3.11×10-1拷贝/μL。

1.3.6 RT-qPCR检测稳定性分析 对7个浓度梯度(3.11×107~3.11×100拷贝/μL)的质粒标准品做3次重复检测,计算Cp值的标准差和均值。计算变异系数(variation coefficient,CV),CV=标准差/平均数×100%,根据CV验证RT-qPCR检测体系的稳定性。

1.3.7 利用RT-qPCR体系检测马铃薯样品 利用建立的RT-qPCR检测体系对已知类病毒感染情况的22个马铃薯试管苗及休眠块茎(表1)进行检测,每个样品重复3次,同时设置阴性和阳性对照以确定反应的可靠性。

2 结果与分析

2.1 菌落的PCR鉴定

通过图1可以看到,所有菌落均为PSTVd阳性菌落,表明PSTVd序列已经成功转化进入大肠杆菌中,这些菌落均可用于标准品制备。

图1

图1   阳性菌落PCR鉴定结果

M: 100bp DNA ladder,扩增产物片段为359bp;1~18: 转化的菌落

Fig.1   The PCR results of the positive colonies

M: 100bp DNA ladder, the amplification product fragment is 359bp; 1-18: transformed colonies


2.2 引物的比较和筛选结果

图2、3和4分别为3对引物所建立的标准曲线。以PSTV 231F和PSTV 296R为引物的检测体系扩增效率大于2,表明该体系可能存在引物二聚体或非特异性扩增(图2);以PSTV 234F和PSTV 350R为引物的检测体系的扩增效率(1.972),相对较低(图3);以引物PSTV 234F和PSTV 356R所建立的检测体系的扩增效率(1.996),最接近荧光定量PCR的最高扩增效率2(图4),符合标准曲线要求,当标准品浓度为3.11×106 ~3.11×1010拷贝/μL时,Cp值同标准品质粒浓度之间呈很好的线性关系,表明该体系可以用来对PSTVd进行定量检测。

图2

图2   以PSTV 231F和PSTV 296R为引物的Real-time PCR标准曲线

标准品中质粒浓度分别为3.11×1010、3.11×109、3.11×108、3.11×107、3.11×106和3.11×105拷贝/μL,下同

Fig.2   The Real-time PCR standard curve for primer pair of PSTV 231F and PSTV 296R

The plasmid concentration in the standard are 3.11×1010, 3.11×109, 3.11×108, 3.11×107, 3.11×106, and 3.11×105 copies/μL, respectively. The same below


图3

图3   以PSTV 234F和PSTV 350R为引物的Real-time PCR标准曲线

Fig.3   The Real-time PCR standard curve for primer pair of PSTV 234F and PSTV 350R


图4

图4   以PSTV 234F和PSTV 356R为引物的Real-time PCR标准曲线

Fig.4   The Real-time PCR standard curve for primer pair of PSTV 234F and PSTV 356R


2.3 检测灵敏度

综合比较3组引物的扩增效率和误差等因素,PSTV 234F、PSTV 356R以及PSTV 251T所建立的体系为最优体系。因此,选择该体系进行灵敏度测试。从图5可以看到,当质粒浓度为31.1拷贝/μL时,依然有很强的扩增信号,且Cp值与质粒浓度之间仍然保持较好的线性关系,故本体系检测的灵敏度可达31.1拷贝/μL(101.17ag/μL)。

图5

图5   3组引物建立体系的灵敏度测试

各标准品的浓度依次为3.11×107~3.11×10-1拷贝/μL

Fig.5   Sensitivity detection of three primer sets

The concentration of each standard is 3.11×107-3.11×10-1 copies/μL


2.4 RT-qPCR检测稳定性

对3.11×107~3.11×100拷贝/μL的质粒标准品做3次重复检测,结果见表3。同一质粒浓度的Cp值非常接近,变异系数比较低;不同质粒浓度各自的Cp值变异系数分别为1.64%、0.61%、1.80%、0.47%、0.92%、1.11%、1.45%和0.98%,均小于2.00%,总体表现比较稳定,说明该检测方法具有较好的稳定性。

表3   PSTVd RT-qPCR 检测方法稳定性分析

Table 3  Stability analysis for PSTVd detection by RT-qPCR

质粒浓度(拷贝/μL)
Plasmid concentration (copies/μL)
Cp1Cp2Cp3Cp平均值
Cp mean
标准差
Standard deviation
变异系数
Variation coefficient(%)
3.11×10717.9617.8817.4217.750.291.64
3.11×10619.8919.9420.1219.980.120.61
3.11×10521.2821.8122.0421.710.391.80
3.11×10424.7924.6024.8124.730.120.47
3.11×10328.2228.0727.7228.000.260.92
3.11×10232.0531.3631.5831.660.351.11
3.11×10133.9934.6034.9834.520.501.45
3.11×10037.7136.9837.4037.360.370.98

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2.5 利用RT-qPCR检测技术体系检测马铃薯样品

从测试样品的扩增曲线(图6)中可以看出,阳性样品扩增曲线为典型的“S”型,阴性样品曲线平滑,无明显翘尾,检测结果与NASH法检测结果(表1)一致,表明检测结果准确可靠。

图6

图6   利用建立的RT-qPCR 体系检测PSTVd的扩增曲线

Fig.6   The amplification curve established by RT-qPCR system for detection of PSTVd


3 讨论

虽然国家标准《马铃薯种薯》-GB 18133-2012中明确规定PSTVd为检疫性有害生物,但尚没有对脱毒马铃薯种薯实行PSTVd的强制性检测,且早期马铃薯种质资源交流和繁育等过程中对PSTVd的检测和防控重视不足,使得PSTVd在种薯或种质资源中都持续存在,是威胁我国马铃薯生产和常规育种的一个重要病害。

在防控PSTVd的过程中,R-PAGE、NASH和RT-PCR等常规检测技术仍然在种薯质量检测中使用,但上述方法存在灵敏度低、耗时较长和不能绝对定量等缺点。据报道,R-PAGE的检测灵敏度为500pg[10];吕典秋等[11]利用生物素标记作为探针,以CDP-Star作为底物时,其NASH检测体系可检测提纯的PSTVd最低量为5pg;何小源等[12]采用RT-PCR技术检测PSTVd的可检出量为0.15pg。近年来,随着测序技术的不断发展,利用小RNA高通量测序技术检测植物病毒、类病毒的方法也得到了一定的应用[13,14,15]。但该方法耗时比较长,而且成本高,日常检测中很少采用。赵晓丽等[16]建立的啤酒花矮化类病毒HSVd RT-qPCR检测体系的灵敏度为1.0×102拷贝/μL;郭立新等[17]建立的啤酒花潜隐类病毒(HpLVd)RT-qPCR检测体系的灵敏度为25μL的反应体系中,总RNA含量达到20pg时能够被检测到。本研究建立的PSTVd的RT-qPCR检测体系灵敏度可达31.1拷贝/μL(101.17ag/μL),与同类检测技术相比,其灵敏度较高,且由于特异性探针的引入,提高了其检测的特异性。

4 结论

本研究建立的PSTVd RT-qPCR检测体系操作简便,特异性强,稳定性好,自动化程度高,可绝对定量分析,灵敏度达31.1拷贝/μL,且不需要凝胶电泳等程序,检测时间短,可为PSTVd的防控和科学研究提供技术支持。

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植物保护学报, 2013,40(4):309-314.

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Hop stunt viroid, HSVd)的实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法,设计了2对引物及特异探针,体外转录制备了RNA标准品,绘制标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数对数之间呈良好的线性关系,相关系数R2为0.9988,扩增效率为95%;该方法的特异性好,与啤酒花潜隐类病毒(HLVd)、葡萄黄斑类病毒1(GYSVd-1)、葡萄黄斑类病毒2(GYSVd-2)和桃潜隐花叶类病毒(PLMVd)均无交叉反应;灵敏度为1.0×102拷贝/μL,比普通RT-PCR高10倍;试验内及试验间重复性试验的变异系数均小于3%。研究表明该方法适用于实际样品中HSVd的快速定量检测。]]>

郭立新, 段维军, 张祥林 , .

啤酒花潜隐类病毒的实时荧光RT-PCR检测

植物病理学报, 2012,42(5):466-473.

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近年来,四川省冕宁县大力发展樱桃产业,全县樱桃种植面积1 500 hm2,年产量已达到1 3000 t,是凉山有名的樱桃之乡。2009年开始,在部分樱桃园发现花变绿症状果树,随后发病面积逐年扩大,2011年发病面积已达总栽培面积的3%,发病果园病株率可达10%~40%,对冕宁县樱桃产业造〖HJ*2/3〗成潜在威胁。本研究针对植原体进化过程中的保守基因(16S rRNA和核糖体蛋白rp基因),采用分子生物学方法对冕宁县采集到的表现花变绿症状的樱桃植株进行检测鉴定,以明确病原及株系的分类地位,为该病害的防治提供参考。

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