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滇重楼[Paris polyphylla Smith var. yunnanensis.(Franch.) Hand.-Mazz.]为延龄草科重楼属多年生草本植物,其茎为主要药用部分,具有清热解毒、消炎止痛等功效,被历年中国药典收载^[1,2]。滇重楼根茎中富含甾体皂苷类药用成分,具有调节免疫、止痛、止血以及抗肿瘤等功效,临床上常用于治疗炎症性疾病和肿瘤等,也是“云南白药”和“宫血宁”等著名中成药的主要原料^[3]。滇重楼及其产品疗效确切,运用广泛,而其野生资源远不能满足需求,21世纪初已开始进行人工驯化栽培。滇重楼生长缓慢,年消耗生物量远超生长量,因此,需要通过人工栽培技术来提高滇重楼的产量。丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal,AM）是自然界中分布最为广泛的一种共生体,陆地上约90%的被子植物能与其形成互惠共生体^[4,5],因此,AM真菌可作为微生物肥料用于药用植物栽培。已有大量的研究报道AM真菌对药用植物的促生作用,如牡丹^[6]、黄花蒿^[7]等。研究表明,滇重楼是典型的能与AM真菌共生的Paris型丛枝菌根植物,对AM真菌有不同程度的依赖性^[8,9];AM真菌能影响滇重楼药用成分的代谢,通过提高滇重楼成年植株光合作用与保护酶活性、增加叶片中可溶性蛋白与可溶性糖含量,促进滇重楼生长^[9,10]。

利用滇重楼的根茎栽培模式繁殖系数低,成本高,且滇重楼种子具有需要休眠后方能萌发的生理学特性^[11,12],加之实生苗生长极为缓慢,需栽培8~10年才能药用。目前,尚未见关于AM真菌对滇重楼幼苗的促生作用的报道。本研究通过盆栽试验,利用滇重楼幼苗接种多种AM真菌,观察菌根侵染情况和对滇重楼幼苗形态、光合特性及相关生理生化指标的影响,以期为AM真菌促进滇重楼实生苗生长提供理论依据。

本研究所用AM真菌购于美国真菌种质资源保藏中心,接种所用的AM真菌均带有孢子、菌丝和栽培基质（表1）。

滇重楼种子采自云南省大理州农业科学推广研究院栽培的滇重楼植株。种子采收后,在常温条件下沙藏4个月。试验前用细沙磨破,去掉红色假种皮,用双蒸水冲洗2次,再用10% NaClO溶液杀菌处理15min,再次用双蒸水冲洗后备用。利用紫云英种子扩繁AM真菌,紫云英种子购于上海春菌草坪技术有限公司,种子前处理同滇重楼种子。栽培基质（菜园土与细沙按体积比3:1混合）经121℃高压灭菌2h。

采用室温盆栽方法,设29种处理组,包括未接种任何AM真菌的对照组和接种不同AM真菌的28种处理组,每个处理3次重复,每个重复种植于1个花盆中,选取饱满度均匀且无病害的滇重楼种子撒播于花盆中,每盆播种50粒种子,同时撒播适量的紫云英种子与滇重楼种子混合培养,在滇重楼种子的表土下均匀撒施一层5mL菌土（孢子量约为300个）。待滇重楼出苗后拔掉盆里所有紫云英植株,并根据滇重楼生长情况进行间苗,每盆保留20株滇重楼幼苗;用10% NaClO溶液对栽培袋进行消毒,用双蒸水冲洗3次后备用;接种AM真菌后的滇重楼幼苗于室温、自然光照条件下栽培。植株生长期间按时补充Hoagland营养液。

1.3.1 AM真菌侵染率 每个处理随机抽取30条须根,剪成长约1cm小段,采用曲利本蓝染色法测定侵染率^[13]。1.3.2 生长指标 用直尺及游标卡尺对滇重楼幼苗期叶长、叶宽、株高、茎粗和叶柄直径等生长指标进行测量,每个处理重复6次,每次随机测量10个植株,取平均值。1.3.3 光合色素含量 摘取测定气体交换的叶片,采用张志良等^[14]的方法进行叶片光合色素含量的测定,根据公式计算得出叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）和类胡萝卜素（C_t）的相对含量。1.3.4 叶片气体交换参数 于晴朗少云的上午幼苗叶片气孔张开度最大时,抽取6株滇重楼幼苗,每株1片叶片,采用便携式光合作用仪GFS-3000测定大气CO₂浓度（C_a）、净光合速率（P_n）、蒸腾速率（T_r）、气孔导度（G_s）和胞间CO₂浓度（C_i）等气体交换参数指标。每片叶重复3次,取平均值作为该时刻的实测值;根据测定的气体交换指标计算滇重楼幼苗叶片水分利用效率（WUE）=P_n/T_r和气孔限制值（L_s）=1-C_i/C_a。1.3.5 生理指标 采用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性,采用愈创木酚显色法测定过氧化物酶（POD）活性,采用紫外分光光度法测定过氧化氢酶（CAT）活性,采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）和可溶性糖含量,采用考马斯亮蓝比色法测定可溶性蛋白含量^[14]。

采用Excel 2003、SPSS 17.0进行数据处理与分析,采用LSD法标注显著性,采用SigmaPlot 10.0作图。

由图1可知,在滇重楼苗期,CK组无任何AM真菌侵染;与CK组相比,其余处理组幼苗根系均被AM真菌侵染,且明显产生了Paris型菌根,接种苗侵染率为75.00%~100.00%,但各处理组之间并无显著差异,且各处理组滇重楼幼苗侵染率均显著高于CK组。试验表明,外源AM真菌能够提高滇重楼幼苗根系的侵染率。

如表2所示,各处理组滇重楼幼苗的各项生长指标均无明显差异,AM真菌虽然在苗期就侵染滇重楼根系,但对滇重楼幼苗的形态生长影响不明显。

由图2可知,Gd处理组滇重楼的幼苗叶片叶绿素相对含量显著高于其他处理组;Ga、Gr、Rfu、Afo、Pb和Art处理组的幼苗叶片叶绿素相对含量略低于Gd处理组,差异均显著,且显著高于其他处理组;Gg、Sca、Sdi、Dh、Rco、Svi、Fm、Cc、Rcl、Rin、Asc、Ds、Ec和Po 14个处理组的幼苗叶片叶绿素相对含量略高于CK组;Gm、Spe、Sde、Ako、De和Ale处理组的幼苗叶片叶绿素相对含量和CK组差异均不显著;Asp处理组的幼苗叶片叶绿素相对含量略低于CK组。

由表3可知,AM真菌侵染处理的各处理组的幼苗叶片光合色素的含量明显不同。Ga、Po和Ds处理组的类胡萝卜素均显著高于CK组,其他处理组类胡萝卜素均显著低于CK组。Ga、Gm和Po处理组的叶绿素a含量均显著高于CK组,其他处理组均低于CK组。Ga、Gd、Gm和Po处理组的叶绿素b含量均显著高于CK组,其他处理组均低于CK组。Ga、Po和Ds处理组的叶绿素总量均显著高于CK组,其他处理组均显著低于CK组。

所有处理组滇重楼幼苗叶片的叶绿素a含量均远高于叶绿素b含量,所有处理组的滇重楼幼苗叶片叶绿素a与叶绿素b的含量比值均大于2.7899±0.0070,叶绿素a/b为2.5900±0.1100的范围。

AM真菌处理组下,对滇重楼幼苗叶片光合特征参数间进行相关性分析,由表4可知,滇重楼幼苗叶片P_n与T_r和C_i呈极显著相关,P_n与WUE和L_s呈显著相关;在一定程度上,P_n受WUE和L_s影响;T_r与G_s呈极显著正相关,这2个因子间关系密切,而G_s主要受控于T_r;G_s与L_s呈极显著正相关;WUE与C_i呈极显著负相关,与L_s呈极显著正相关。

由表5可知,滇重楼幼苗接种不同AM真菌对其幼苗期叶片的生理生态因子等光合作用相关参数的影响不同。多个处理组的P_n、T_r、WUE、G_s、L_s和C_i等因子显著高于CK组,且光合作用相关参数的最大值分别为Fm、Fm、Atr、Fm、Atr和Rin处理组。

由图3可知,滇重楼幼苗接种AM真菌影响其幼苗期叶片的CAT、POD和SOD活性,且对3种酶的影响因接种真菌的不同而不同。与CK组相比,仅Rfu、Spe和Po处理组的CAT活性显著低于CK组,其他处理组与CK组无显著差异或略有升高。Ds、Svi、Ale、Spe和Sde处理组的POD活性显著高于CK组,其他组均显著低于CK组。Fm、Asc、Spe、Dh和Cc处理组的SOD活性显著高于CK组,其他处理组均明显低于CK组。

由图4可知,接种不同AM真菌后,滇重楼幼苗叶片MDA、可溶性糖和可溶性蛋白含量表现出不同响应。Cc处理组的MDA和可溶性糖含量均显著高于其他处理组,达到最高值。Gg和Ga处理组的可溶性蛋白含量相对较高,二者间无显著性差异,但Gg处理组显著高于其他处理组。

由表5、图3和图4可知,接种不同AM真菌的滇重楼幼苗叶片的光合能力与其抗逆性没有一致性,Fm、Atr和Rin处理组的叶片光合效率最高,CAT、POD和SOD活性最高分别为Afo、Ds和Asc处理组,MDA、可溶性糖和可溶性蛋白含量最高分别为Cc、Cc和Gg处理组。由此表明,在滇重楼幼苗期,其抗逆性强弱并不能反映其光合效率高低。

本试验中对滇重楼幼苗接种外源性AM真菌其侵染率为75.00%~100.00%,高于滇重楼成年植株接种58.87%~98.30%的侵染率^[15],且在接种过程中受栽培基质内其他微生物影响较小,表明滇重楼种子育苗阶段是接种外源性AM真菌的最佳时期;不同外源AM真菌对幼苗阶段生长形态无显著影响,但能显著提高滇重楼幼苗叶片叶绿素含量,并使得幼苗期的叶片叶绿素a/b值提高,有利于提高滇重楼幼苗叶肉细胞的光适应性^[15],说明AM真菌与滇重楼幼苗也能共生形成良好生长所依赖的Paris型菌根,这与周浓等^[8,16]、段艳涛等^[9]研究结果一致;同时滇重楼幼苗叶片中叶绿素a/b值虽高于阴生植物的叶绿素a/b值范围^[17],但是低于滇重楼成年植株的叶绿素a/b值,符合滇重楼野生居群适应其自然生长环境的特点,即在幼苗期植株矮小,有灌木丛、落叶层或草丛的遮掩,植株成年后,茎秆就会显著伸长探出荫蔽物以获取更多光照,说明在滇重楼栽培过程中对光照的需求是变化的,如在滇重楼种植过程中适当增加光照强度,可能会促进其生长。

AM真菌处理组光合特征参数分析结果表明,滇重楼幼苗叶片P_n、T_r和C_i生理生态因子具有较好的协同响应特征,同时在一定程度上,P_n还受WUE和L_s影响;此外,结果表明滇重楼幼苗叶片自身气孔因素致L_s增大,促使气孔关闭,WUE和P_n降低;滇重楼幼苗叶片P_n随着其C_i升高而降低,因此维持基本生命需求,只有通过降低L_s,打开更多的气孔来实现光合效率;其他生理生态因子与P_n、T_r、G_s、C_i、WUE和L_s相关性均不显著,因而不能单以叶片的光合色素含量作为光合作用强弱的判断指标。

有研究表明,AM真菌与滇重楼共生能通过提高滇重楼成年植株光合作用强度与保护酶活性、增加叶片中可溶性蛋白与可溶性糖含量,从而促进滇重楼生长,并能提高宿主的抗逆性^{[15-16,18-19]},但尚未见外源性AM真菌对滇重楼幼苗期生理生长特性的研究。本试验中不同真菌对滇重楼幼苗的生长促进作用因AM真菌不同而异,存在种间差异,某些AM真菌侵染滇重楼后,其幼苗期的叶片的CAT、POD、SOD活性明显增强,叶片MDA含量降低、可溶性糖和可溶性蛋白含量增加,表明滇重楼接种特定AM真菌在幼苗期就能提高其生理活性及抗逆能力。

滇重楼种子播种时接种外源性AM真菌是适宜的时期,多种外源AM真菌均能在种苗繁育期有效侵染其幼苗根系,但对植株生长形态无显著影响;绝大多数AM真菌均能够促进幼苗期滇重楼叶片叶绿素合成,提高幼苗光合能力,对于滇重楼幼苗期生长具有促进作用;接种外源性AM真菌宜在种苗繁育期进行。综合滇重楼接种AM真菌后幼苗多种生理生化指标,选择Acaulospora scrobiculata和Ambispora leptoticha等AM真菌可以提高滇重楼幼苗光合能力、抗逆能力;同时,滇重楼生长周期中具有对光照需求逐渐增大的特性,建议在生产管理中,对于不同生长期的滇重楼应施予不同的光照强度。