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叶片是小麦进行光合作用的重要场所,其光合同化产物对小麦生长发育与产量形成具有非常重要的作用。灌浆期是小麦产量形成的重要时期,在灌浆期间如遭受干旱胁迫,叶片会发生失绿早衰,提前结束光合作用,最终造成大幅减产,而这一现象在我国干旱与半干旱地区尤为突出^[1]。已有研究表明,作物持绿能够延迟绿色光合器官的衰老^[2],延长有效光合时间并维持较大的光合面积,提高作物光合效率^[3,4,5],对干旱胁迫具有较强的耐受性,进而促进产量的形成^[6,7]。此外,作物持绿可以提高其自身对高温^[8,9]、盐碱化^[10]和斑枯病^[11]等非生物胁迫与生物胁迫的抗逆性。因此,快速有效地对持绿性状进行评价,提高筛选小麦持绿突变体的效率,缩短抗逆新品种选育年限,对缓解我国华北、西北等地区小麦遭受干旱胁迫减产的问题具有重要意义。

目前,对各种作物仍无统一的持绿评价标准,小麦持绿研究以叶绿素含量、功能绿叶面积持续期（green leaf area duration,GLAD）以及衰老相关参数等指标为主^[1,12-13]。Zhang等^[7]研究了灌浆中期小麦旗叶叶绿素a、叶绿素b含量与产量之间的关系,结果表明,灌浆中期叶绿素a、叶绿素b含量与单株产量呈极显著正相关,认为灌浆中期小麦叶绿素含量可用于持绿评价。Vijayalakshmi等^[8]利用Ventnor与Karl 92构建的小麦RIL群体对小麦灌浆期GLAD进行了测定,认为该指标可进行持绿评价。Wang等^[14]和梁增浩^[15]利用旱选10与鲁麦14构建的DH群体对小麦灌浆期衰老相关参数进行了研究,结果表明,单株产量与衰老起始时间等衰老参数呈极显著正相关,并以衰老参数对小麦DH群体进行聚类分析,将DH群体的持绿性划分为3类。然而持绿表型数据评价标准不同,必然使得小麦持绿分子标记定位结果缺乏一致性^[2,7,15-16],对后续的精细定位与图位克隆造成一定的影响,制约小麦分子育种进程。上述研究均仅从同一个环境条件下进行了分析研究,无法预测其研究结果是否适用于多环境条件下的持绿性评价分析。鉴于此,本研究以旱选10号×鲁麦14构建的包含306个家系的RIL群体为材料,对比分析了2种水分条件下不同灌浆时期的旗叶叶绿素含量（SPAD值）、GLAD、衰老相关参数等持绿表型性状及其与产量性状的相关性,以期寻求简单易行、能在多个环境条件下适用的小麦持绿评价指标,为快速筛选小麦持绿突变体,加速抗旱、高光效育种进程提供依据。

由中国农业科学院利用旱选10号和鲁麦14构建的包含306个家系的RIL群体为材料。其中母本旱选10号是山西省农业科学院从大量小麦种质资源中筛选育成的抗旱品种,父本鲁麦14是山东省烟台市农科所育成的水地高产品种,该群体双亲在抗旱性上具有较大的遗传差异。

2017年9月27日将RIL群体亲本与各家系种植于山西农业大学农作站（112°25′ E,37°25′ N）。水分处理分为正常灌溉（well-watered,WW）和干旱胁迫（drought-stress,DS）。随机区组设计,共设3次重复。每个重复材料按照行长2m,行距0.25m,每行40粒的标准进行种植,双行区点播。

播种前统一浇足底墒水,播种后干旱胁迫处理全生育期只依靠自然降水,小麦整个生育期内降水量约为206mm;正常灌溉处理分别在越冬前、拔节期和开花期,每次灌水量600m³/hm²。

1.3.1 旗叶SPAD值的测定 于开花期（小区50%穗部开花的时期）,在亲本与每个家系中选取开花一致、发育正常、长势一致的5株小麦进行挂牌标记。从开花期当日起（亲本与各家系花期时间不同）使用SPAD-502（Konica-Minolta,日本）叶绿素仪测定双亲与各家系标记的5株小麦的旗叶SPAD值。每片旗叶均在叶基部、中部和尖部测定3次,取平均值;测定时间为上午7:00-10:00。每隔5d测定1次,直至成熟,期间共测定7次。7个时期分别记为S1（花后0d）、S2（花后5d）、S3（花后10d）、S4（花后15d）、S5（花后20d）、S6（花后25d）和S7（花后30d）。

1.3.2 旗叶GLAD的测定 于开花期,在亲本与每个家系中选取开花一致、发育正常、长势一致的10株小麦进行挂牌标记。参照Wang等^[14]的方法,根据小麦旗叶的绿叶面积,目测将其划分为0~9共计10个等级,0为旗叶完全衰老,9为旗叶完全保持绿色。从开花后10d（亲本与各家系时间不同）开始测定,之后每隔3d测定1次GLAD,直至收获,期间共测定7次。7个时期分别记为D1（花后10d）、D2（花后13d）、D3（花后16d）、D4（花后19d）、D5（花后22d）、D6（花后25d）和D7（花后28d）。

1.3.3 产量性状的测定 小麦成熟后,每个家系随机选取10株,连根拔除,晾干,以10株的平均值作为每个家系的测定值。10株小麦混合脱粒后,计算其平均值即为单株产量;小麦脱粒后使用数粒仪数取1 000粒籽粒,称重,即为千粒重;10株小麦结实总穗数的平均值即为单株穗数;10株小麦总粒数除以总穗数的平均值即为穗粒数。

1.3.4 籽粒性状的测定 每个家系选取10粒大小较为均一的籽粒,使用游标卡尺测量粒长、粒宽和粒厚并计算其平均值。

1.4.1 持绿性状与产量性状的统计分析 采用Excel和SPSS 19.0统计分析软件对小麦RIL群体以及双亲各时期的GLAD、SPAD值、单株产量、千粒重、单株穗数、穗粒数、粒长、粒宽和粒厚进行基本统计分析,包括均值、标准差、变异范围、变异系数、偏度、峰度以及方差分析和相关性分析。

1.4.2 衰老特征参数的计算 由于小麦旗叶GLAD变化符合Gompertz方程的特征,故用Gompertz方程进行拟合^[15],即GLAD=ke^-be-at。对Gompertz曲线求一阶导数和二阶导数,得到相关初级参数和次级参数：最大衰老速率（MRS）、达到最大衰老速率的时间（TMRS）、最大衰老速率时GLAD的百分比（PGMS）、衰老起始时间（Ts）、完全衰老时间（To）、从开花当天到75%GLAD的时间（75%G）、75%G与25%G之间的时间（50%G）、从开花当天到25%G的时间（25%G）^[15]。

2.1.1 RIL群体与亲本SPAD值变异分布 2种水分条件下,小麦开花期至成熟期,RIL群体与亲本的SPAD值均呈下降趋势（表1）。正常灌溉条件下,RIL群体与亲本的旗叶快速衰老主要集中在花后15、20和25d;干旱胁迫条件下,母本旱选10号与RIL群体的旗叶在花后15、20和25d迅速衰老,而父本鲁麦14的旗叶快速衰老主要集中在花后10、15和20d。

正常灌溉条件下,父本鲁麦14旗叶SPAD值在花后0、5、10、15和20d均高于母本旱选10号,但在花后20、25和30d低于母本（花后30d时差异达到显著水平）;干旱胁迫条件下,父本鲁麦14旗叶SPAD值在花后0、5和10d高于母本旱选10号（其中花后0d时差异达到显著水平）,而在花后15、20和25d显著或极显著低于母本旱选10号（表1）。

从表1还可发现RIL群体SPAD值在花后5、10、15、20和25d的变异系数均呈现出干旱胁迫条件下高于正常灌溉条件下,即干旱胁迫可能导致SPAD值变异更为广泛,表明各家系对干旱胁迫的敏感程度不同。

2.1.2 RIL群体与亲本GLAD的变异分布 2种水分条件下,灌浆期RIL群体与亲本GLAD的变化与SPAD值具有类似的趋势,即随着灌浆时间的延长,GLAD呈下降趋势（表1）。在正常灌溉条件下,RIL群体与亲本的旗叶快速衰老主要集中在花后15、20和25d;在干旱胁迫条件下,母本旱选10号与RIL群体的旗叶在花后15、20和25d迅速衰老,而父本鲁麦14的旗叶快速衰老主要集中在花后10、13、16、19和22d,该结果与SPAD值变化趋势一致。

正常灌溉条件下,父本鲁麦14旗叶GLAD在花后10和13d显著高于母本旱选10号,但在花后19、22、25和28d低于母本（花后19d时差异达到显著水平）;干旱胁迫条件下,母本旱选10号旗叶GLAD在花后10、13、16、19和22d高于父本鲁麦14（花后13、16和19d时差异均达到显著水平）（表1）。

2.1.3 RIL群体与亲本衰老特征变异分布 正常灌溉条件下,母本旱选10号的MRS、PGMS、Ts和To较父本鲁麦14具有显著性差异（P<0.05）;而在干旱胁迫条件下,除PGMS与75%G外,双亲其余各衰老参数差异均达显著（P<0.05）或极显著水平（P<0.01）（表1）。

正常灌溉条件下,RIL群体除MRS、25%G与To外,其余各衰老参数均介于双亲之间,呈现连续性分离;干旱胁迫条件下,RIL群体仅有Ts和To介于双亲之间,其余各参数均高于或低于双亲,表现出明显的双向超亲分离现象（表1）。

正常灌溉条件下母本旱选10号与父本鲁麦14的千粒重、单株产量与单株穗数差异均不显著。而在干旱胁迫条件下,母本旱选10号的千粒重、单株产量、单株穗数与穗粒数均显著高于父本鲁麦14（表2）,说明母本旱选10号在干旱胁迫条件下具有较好的产量表现。

RIL群体产量相关性状均呈现出正常灌溉条件高于干旱胁迫条件的趋势。正常灌溉条件下RIL群体千粒重、单株产量平均值发生双向超亲分离,而2种水分条件下RIL群体其余各产量相关性状平均值介于双亲之间,呈现连续正态分布。

2.3.1 SPAD值与产量性状的相关性 正常灌溉条件下,花后15、20、25和30d的SPAD值与千粒重呈显著或极显著正相关;花后10、15、20、25和30d的SPAD值与单株产量呈显著或极显著正相关;花后10、15和20d的SPAD值与单株穗数呈显著或极显著正相关;花后0、5、10、15和20d的SPAD值与穗粒数呈显著或极显著正相关。干旱胁迫条件下,花后20、25和30d的SPAD值与千粒重均呈极显著正相关,除花后0d之外,其余各时期SPAD值均与单株产量呈显著或极显著正相关;花后5和10d的SPAD值与单株穗数呈显著正相关,花后0、5、10、15和20d的SPAD值与穗粒数均呈极显著正相关（表3）。

2种水分条件下,灌浆各时期SPAD值与粒长均无显著相关性。花后20、25和30d的SPAD值均与粒宽呈显著或极显著正相关,其相关系数为0.13~0.26。干旱胁迫条件下,花后20、25和30d的SPAD值与粒厚均呈极显著正相关,相关系数为0.18~0.21;而正常灌溉条件下仅有花后25d的SPAD值与粒厚呈极显著正相关（r=0.24）,其余时期SPAD值与粒厚无显著相关性（表3）。

2.3.2 GLAD与产量性状的相关性 2种水分条件下,灌浆不同时期旗叶GLAD与产量性状的相关性分析结果见表4。在正常灌溉条件下,花后10、13、16和19d的GLAD与粒长呈显著或极显著正相关;花后19、22、25和28d的GLAD与粒宽呈显著或极显著正相关,花后22、25和28d的GLAD与粒厚呈显著或极显著正相关。在干旱胁迫条件下,花后10和13d的GLAD与粒长呈显著或极显著正相关;花后19、22和25d的GLAD与粒宽呈显著或极显著正相关;花后22和25d的GLAD与粒厚呈显著或极显著正相关。

在正常灌溉条件下,花后16、19和22d的GLAD与千粒重呈极显著正相关;花后10、13、16、19和22d的GLAD与单株产量和穗粒数均呈极显著正相关。在干旱胁迫条件下,花后10、13、16、19和22d的GLAD与千粒重呈显著或极显著正相关,花后25d的GLAD与穗粒数呈显著正相关。

2.3.3 衰老参数与产量性状的相关性 2种水分条件下,旗叶衰老参数与产量性状的相关性分析结果见表5。在正常灌溉条件下,MRS与单株产量、单株穗数以及穗粒数均呈极显著负相关;TMRS与千粒重、单株产量和穗粒数呈显著或极显著正相关;Ts与千粒重、单株产量、单株穗数及穗粒数均呈极显著正相关性;To与千粒重呈显著正相关性。在干旱胁迫条件下,MRS与单株产量及穗粒数呈显著或极显著负相关性;Ts与千粒重及穗粒数呈显著正相关性;To与千粒重及单株产量分别呈显著正相关与显著负相关。

小麦产量形成的关键时期是灌浆期,这一时期的光合产物对籽粒干重的贡献为50%~67%^[17]。此时期普通小麦旗叶对水分亏缺最为敏感,容易失绿早衰,降低光合效率导致减产。而持绿品种则表现为具有较高的叶绿素含量、较大的光合面积以及较长的光合持续时间,最终得以保证产量的正常形成^[8,14,18-19]。作为评价小麦持绿性状的主要指标,叶绿素含量的高低直接影响着小麦的光合速率与光合产物^[20,21];功能绿叶面积及其持续期则决定了叶片的光合面积与光合时间;衰老相关参数则影响光合时间的长短,均是小麦产量形成的重要影响因素^[22]。本研究中发现旗叶SPAD值与GLAD在整个灌浆期的变化呈现出动态复杂的过程,2种水分条件下,RIL群体在灌浆前期缓慢下降、灌浆中后期迅速下降、灌浆末期缓慢下降的趋势,整个动态发育过程呈现出“慢-快-慢”的变化特点。这个变化趋势与同时期小麦的灌浆曲线^[1]以及籽粒淀粉含量变化趋势相吻合^[23],说明叶片衰老与产量的形成是同步进行的,二者均表现出动态变化的特点,但衰老相关参数则无法直接反映出小麦产量形成的复杂变化过程。

研究小麦叶片持绿的目的是为了提高产量,通过对比分析不同水分条件下SPAD值与GLAD动态变化特征及其与产量之间相关性,对于叶片持绿的评价具有重要的指导意义。Spano等^[24]研究表明,旗叶叶绿素含量与净光合速率呈显著正相关性,叶片持绿提高了千粒重与单株产量。Zhang等^[7]研究结果证实灌浆中后期旗叶叶绿素含量对产量形成具有重要的作用。本研究也有类似的发现,即在灌浆早期与中期,SPAD值与籽粒性状及单株产量无明显相关性;而在灌浆后期（花后20、25和30d）SPAD值与粒宽、粒厚、千粒重以及单株产量呈显著或极显著正相关,这是由于灌浆初期光合同化产物主要用于完善茎秆、叶片等器官形态构建,而在灌浆中后期维持较高的叶绿素含量能使得更多的光合同化产物被运输至籽粒,促进千粒重增加,最终促进产量的形成。Reynolds等^[25]认为小麦持绿对千粒重的形成具有重要的作用,尤其是在干旱胁迫条件下。本研究发现在灌浆后期干旱胁迫条件下SPAD值与千粒重的相关系数高于正常灌溉。Gorny等^[26]发现GLAD与收获指数呈显著正相关;梁增浩^[15]发现GLAD与产量之间具有很强的相关性;贾丽^[1]研究结果表明,GLAD与穗粒数与穗粒重呈显著正相关性。本研究也发现花后16、19和22d的GLAD与千粒重呈显著或极显著正相关,但GLAD与单株产量的相关性则因水分条件的不同具有较大的差异。即正常灌溉条件下花后10、13、16、19和22d的GLAD与单株产量呈极显著正相关,而干旱胁迫条件下GLAD与单株产量相关性未达到显著水平,表明GLAD与产量性状的相关性因水分条件的不同而具有较大差异,换句话说,如果将GLAD应用于多环境下进行持绿评价,其评价结果必然具有一定的局限性。综上所述,旗叶SPAD值在灌浆中后期（花后20、25和30d）相比于GLAD和衰老特征参数与产量性状具有更好的相关性,且测定相对简单,可能更适宜用于多个环境下持绿性状的评价。本研究结果可为在不同水分条件下进行小麦功能性持绿材料的筛选提供参考,这对于提高抗旱育种效率、推进抗旱育种进程具有一定的意义。

旗叶SPAD值与GLAD在小麦整个灌浆期的变化呈现出“慢-快-慢”的变化特点,体现出灌浆期持绿相关性状动态复杂的变化过程,但衰老相关参数则无法直接反映小麦产量形成的动态变化。旗叶SPAD值在灌浆中后期（花后20、25和30d）相比于GLAD和衰老特征参数与产量性状具有更好的相关性,且测定相对简单,更适宜用于多个环境下持绿性状的评价。