开放科学（资源服务）标识码（OSID）： 
糯玉米是受1对隐性糯质基因（wxwx）控制的玉米胚乳突变类型。Wx基因编码颗粒凝结型淀粉合成酶（GBSSI）,是玉米胚乳造粉体中催化ADP葡萄糖合成直链淀粉的主要同工酶之一[1]。在普通玉米中,GBSSI的活性较高,所合成的直链淀粉不能由淀粉分支酶全部转化为支链淀粉,成熟胚乳积累约1/4的直链淀粉,表现为非糯性[2]。在糯玉米中,Ac-Ds、S-pm等转座子插入wx基因各外显子的不同位点或者wx基因缺失,显性基因Wx突变为隐性基因wx,改变颗粒凝结型淀粉合成酶的蛋白质结构,颗粒凝结型淀粉合成酶的活性被抑制而其他活性较低的同工酶合成的直链淀粉全部由淀粉分支酶转化为支链淀粉,胚乳中只积累支链淀粉,表现为糯性[1,2,3,4]。
由于我国糯玉米杂交育种起步较晚,糯质骨干系较少,而用地方种质选育的一环系表现为丰产性和配合力较低,且糯质基因只受1对隐性基因（wxwx）控制[5,6,7,8],因此,通过回交育种方法,利用普通玉米优良基因改良糯玉米种质已成为糯玉米育种的主要方法之一。通过观察自交世代种子胚乳的透明度,选择胚乳不透明的种质,达到保留隐性糯质基因的目的,分子标记辅助选择可避免环境条件的干扰,直接对基因型进行选择[9]。分子标记辅助选择不仅可在早代进行准确、稳定的选择,而且可克服隐性基因识别难的问题,直接鉴定隐性糯质基因的杂合单株[10,11],省去自交分离的世代,可大大缩短育种年限,加快育种进程[12],提高育种效率。
本研究以普通玉米优良自交系昌7-2为轮回亲本,以糯玉米自交系云539为供体亲本,通过挖掘糯玉米自交系云539的wx基因序列,开发分子标记并验证,然后利用开发的该分子标记辅助选择回交转移糯质基因wx,创制糯玉米新种质,为选育高产糯玉米杂交种提供材料基础,同时也为分子标记辅助选择单基因或少数主效基因控制的性状提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
选用普通玉米优良自交系昌7-2、郑58和糯玉米优良自交系云539、w359、w360、云413、98-1329、w441、w272和F002为供试材料。
1.2 试验方法
1.2.1 功能标记的开发 分别取10粒自交系昌7-2和糯玉米自交系云539的种子在光温培养箱中培养14d,采集幼嫩叶片,采用简化CTAB法[23,24,25]快速提取基因组DNA。从NCBI（
表1 分段扩增waxy基因的引物
Table 1
| 编号 Number | 引物名称 Primer name | 5′-3′引物序列 5′-3′ primer sequence | 退火温度 Annealing temperature (℃) | 扩增条带长度 Length of amplify band(bp) |
|---|---|---|---|---|
| A-F | Wxe3-7 | GTCTTCTTCGTGCTCTTGCC | 57.4 | 907 |
| A-R | GATGCCGTGGGACTGGTAG | 58.2 | ||
| B-F | Wxe4-9 | GTTGACCACCCACTGTTCCT | 56.6 | 880 |
| B-R | ATGAGCTCCTCGGCGTAGTA | 57.6 | ||
| C-F | Wxe7-10 | AACTACCAGTCCCACGGCATCT | 62.4 | 902 |
| C-R | CACGTCCTCCACCATCTCCAT | 61.7 | ||
| D-F | Wxe9-13 | TGCGAGCTCGACAACATCATGCG | 70.9 | 1 344 |
| D-R | AGGGCGCGGCCACGTTCTCC | 73.0 | ||
| E-F | Wxe11-14 | GAGAAGTTCCCAGGCAAGGT | 58.1 | 931 |
| E-R | AGCACAAGCAAGCAGCTACA | 57.1 |
1.2.2 功能标记的验证与通用性检测 在天津市武清区梅厂镇周庄村育种基地将糯玉米自交系云539与普通玉米自交系昌7-2杂交,构建F2代群体。用蔗糖提取液法[26]快速提取胚乳DNA,利用开发的功能标记FMD7检测F2代分离群体在wx位点基因型（WxWx、Wxwx和wxwx）。并将未破坏胚的种子播种,自交授粉,根据F3代种子晒干后的透明度[26],进行表型鉴定。选取糯玉米骨干自交系云539、w359、w360、云413、98-1329、w441、w272、F002和普通玉米杂交种郑单958的亲本（郑58和昌7-2）种子为材料,在光温培养箱中培养14d,采用CTAB法提取叶片基因组DNA。以开发的功能标记FMD7为引物进行PCR扩增,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,分析功能标记FMD7在糯玉米种质资源中的通用性。1.2.3 功能标记FMD7在糯玉米新种质创制上的应用 将材料种植于天津市武清区梅厂镇周庄村育种基地。用云539与昌7-2组配F1,并用F1与轮回亲本昌7-2回交。从BC1F1开始,利用功能标记FMD7辅助选择携带wx基因且表型鉴定综合表现优良的单株,与轮回亲本昌7-2继续回交,直到得到BC3F1种子。将BC3F1种子全部播种并自交,得到80个籽粒非糯质:糯质=3:1的果穗从中挑选胚乳不透明的糯质籽粒,按照单穗混收、种植并自交。根据单株产量,并结合家系内的分离情况和综合农艺性状等综合评判,从中选择性状优良并基本稳定的6个家系用于创新种质的评价。种质评价：采用随机区组设计,2次重复。小区行长5m,行距0.6m,种植密度52 500株/hm2,调查株型性状、产量及其构成因素等。株型性状：性状评价标准依据《玉米种质资源描述规范和数据标准》[27],于散粉期10d后,每个小区从第3株开始,连续调查5株的株高、穗位高、雄穗长和雄穗分枝数,同时测量穗上第1叶的叶夹角。产量及其构成因素：性状评价标准依据《玉米种质资源描述规范和数据标准》[27],成熟后,每行从第3株开始,连续收获5株果穗,风干后进行室内考种,测量穗粗、穗长、穗行数、行粒数和秃尖长,脱粒后测量籽粒重、轴粗和百粒重,并计算出籽率,出籽率=（籽粒重量/果穗重量）×100%。
2 结果与分析
2.1 糯玉米自交系云539 wx基因功能序列的挖掘
运用CTAB法提取自交系云539和昌7-2的基因组DNA,利用预先设计的特异PCR引物分段扩增隐性糯质基因wx和显性非糯质基因Wx,测序并拼接。将拼接完成的wx基因和Wx基因利用DNAman软件进行序列比对,发现2个基因相似度达98.47%。同时将得到的Wx基因和wx基因分别与NCBI网站上的参考序列（GenBank No.：X03935）进行比对,发现相似度分别为87.45%和86.59%,表明本研究扩增测序的DNA序列是Wx基因的不同等位基因序列。我国糯玉米的wx基因主要存在wx-D7和wx-D10两种突变类型[27]。序列比对分析发现（图1）,云539的wx基因属于wx-D7(D7)类型的突变,第7外显子-第7内含子的30bp序列缺失是造成wx基因发生变异、GBSSI蛋白功能缺失的功能基序。而第10外显子没有序列缺失。因此,本研究发现的wx基因第7外显子-第7内含子存在30bp的序列缺失,即wx基因的功能基序。
图1
图1
云539 wx等位基因第7外显子-第7内含子30bp缺失和第10外显子序列
Fig.1
The deletion of 30bp in the 7th exon-7th intron of wx allele gene and the 10th exon sequence in Yun 539
2.2 Wx/wx基因功能标记开发
表2 功能标记FMD7的序列及退火温度
Table 2
| 序号 Number | 引物 Primer | 5′-3′序列 5′-3′ sequence | 退火温度 Annealing temperature (℃) |
|---|---|---|---|
| 1 | FMD7-F | TACCAGTCCCACGGCATCTA | 58.6 |
| 2 | FMD7-R | CACCACCACTACCAGACGAG | 55.7 |
图2
图2
云539糯质基因wx功能标记开发
Fig.2
Development of wx function marker of waxy gene in Yun 539
2.3 功能标记FMD7的表型验证
普通玉米自交系昌7-2与糯玉米自交系云539构建F2代群体,得到种子190粒。提取胚乳DNA,利用开发的功能标记FMD7进行基因型鉴定,结果（表3）显示,wxwx基因型有54粒,Wxwx基因型有86粒,WxWx基因型有47粒,另有3粒未扩增出条带。将种子播种并自交授粉,得到F3代种子,结果发现有7粒种子未出苗,51穗籽粒全部不透明（相应F2代植株基因型为wxwx）,86穗籽粒呈现3:1分离（相应F2代植株基因型为Wxwx）,46穗籽粒全部透明（相应F2植株基因型为WxWx）。经卡方检验结果显示：X2=1.696,P=0.638>0.05,2个鉴定结果吻合,无显著性差异。
表3 F2群体基因型与表型鉴定结果
Table 3
| 基因型 Genotype | 籽粒数Kernel number | X2 | P | |
|---|---|---|---|---|
| 基因型鉴定 Genotype identification | 表型鉴定 Phenotype identification | |||
| wxwx | 54 | 51 | 1.696 | 0.638 |
| Wxwx | 86 | 86 | ||
| WxWx | 47 | 46 | ||
| 其他Other | 3 | 7 | ||
2.4 功能标记FMD7的通用性检测
为了验证功能标记FMD7在糯玉米分子育种中的通用性,利用开发的功能标记FMD7对糯玉米育种的骨干亲本进行检测,结果（表4）表明,自交系w359、w360、云413、98-1329和F002与已知的云539第7外显子-第7内含子30bp缺失带型一致,扩增片段约为74bp,说明这些材料含有隐性的wx基因,而郑58、w441、w272与昌7-2第7外显子-第7内含子非缺失带型一致,扩增片段约为104bp,说明这些材料可能携带显性Wx基因或非云539类型（wx-D7类型）的隐性wx基因。
表4 供试玉米材料标记及糯性分析
Table 4
| 编号Number | 自交系Inbred line | Wx/wx | FMD7 |
|---|---|---|---|
| 1 | 昌7-2 | Wx | - |
| 2 | 郑58 | Wx | - |
| 3 | w359 | wx | + |
| 4 | w360 | wx | + |
| 5 | 云539 | wx | + |
| 6 | 云413 | wx | + |
| 7 | 98-1329 | wx | + |
| 8 | w441 | wx | - |
| 9 | w272 | wx | - |
| 10 | F002 | wx | + |
Note: Wx: non-waxy, wx: waxy; "+": amplification bands same to Yun 539, "-": amplification bands same to Chang 7-2
注：Wx：非糯质,wx：糯质;“+”：扩增条带与云539相同,“-”：扩增条带与昌7-2相同
为进一步验证wx基因分子标记辅助选择结果的可靠性,利用前文设计的5对引物,分段扩增10份玉米自交系waxy基因的全长序列,将拼接后的序列进行多序列比对（图3）。结果表明,10份材料的waxy基因在编码序列（CDS）区域仅存在3处变异,即第7外显子-第7内含子区域,第10外显子区域和第14外显子区域,其他的序列变异均位于内含子区域。昌7-2、郑58、w272和w441不存在第7外显子-第7内含子30bp缺失,而w359、F002、w360、98-1329、云539和云413存在第7外显子-第7内含子30bp缺失（第7外显子的3’端4个碱基和第7内含子的5’端26个碱基）,在该位点转录剪切失效,剩余的第7内含子全部转录,使得终止子TAA提早出现而导致翻译提前中断,GBSSI蛋白功能缺失。这与功能标记FMD7辅助选择结果一致,进一步验证了标记的可靠性。
图3
图3
10份玉米自交系主要突变位点的序列变异
黑色虚线框为wx-D10类型突变位点,红色实线框为第7外显子区域
Fig.3
Sequence variation of the major mutant sites in 10 maize inbred lines
The black dotted box is the mutation site of type wx-D10 and the red implementation box is the 7th exon region
2.5 分子标记辅助选择糯玉米新种质的创制
以云539为供体亲本,昌7-2为轮回亲本,利用功能标记FMD7辅助选择结合表型鉴定,选择出性状优良且基本稳定的6个BC3F2家系,编号11、18、24、38、39和64,并进行综合评价。方差分析结果（表5）显示,基因型对单株产量、秃尖长、百粒重和出籽率影响达极显著水平,对行粒数和轴粗影响达显著水平,其他均无显著性差异。
表5 6个昌7-2糯质改良家系及供体、轮回亲本间产量性状方差分析
Table 5
| 变异来源 Variation source | 单株产量 Grain yield per plant | 穗粗 Ear diameter | 穗长 Ear length | 穗行数 Row number | 行粒数 Kernels per row | 秃尖长 Bare tip length | 轴粗 Shaft diameter | 百粒重 100-kernel weight | 出籽率 Rate of seed |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 基因型Genotype | 597.43** | 0.04 | 0.75 | 4.57 | 45.14* | 0.88** | 0.11* | 2.49** | 0.59** |
| 重复Repeat | 9.00 | 2.00E-03 | 0.09 | 4.00 | 9.00 | 0.00 | 3.00E-03 | 0.30 | 9.00E-03 |
| 误差Error | 66.14 | 0.11 | 3.26 | 4.00 | 6.71 | 0.04 | 0.02 | 0.34 | 0.08 |
Note: "*" and "**" indicate significance and extremely significance at P < 0.05 and P < 0.01, respectively. The same below
注：“*”和“**”分别表示在P<0.05和P<0.01水平显著和极显著。下同
由表6可以看出,除了改良系24的单株产量、改良系18的秃尖长和改良系18、24、38的百粒重均显著高于（P<0.05）昌7-2外,其他改良系的其他性状与昌7-2均无显著差异。改良系11、24和64的出籽率均与昌7-2无显著差异,而18、38和39的改良系出籽率均比轮回亲本显著降低。
表6 6个昌7-2糯质改良家系及供体、轮回亲本产量性状表现
Table 6
| 编号 Number | 单株产量 Grain yield per plant (g) | 穗粗 Ear diameter (cm) | 穗长 Ear length (cm) | 穗行数 Row number | 行粒数 Kernels per row | 秃尖长 Bare tip length (cm) | 轴粗 Cob diameter (cm) | 百粒重 100-kernel weight (g) | 出籽率 Rate of seed (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 云539 Yun 539 | 60.0c | 4.5 | 13.4 | 14.0 | 22d | 1.5a | 2.5ab | 22.7bc | 77.0b |
| 昌7-2 Chang 7-2 | 88.0b | 4.1 | 12.0 | 16.0 | 31bc | 0.0b | 2.2bc | 22.8bc | 88.0a |
| 11 | 108.5ab | 4.4 | 13.2 | 16.0 | 38ab | 0.2b | 2.4b | 23.8ab | 83.6ab |
| 18 | 97.1b | 4.3 | 13.1 | 16.0 | 27cd | 1.5a | 2.8a | 24.8a | 69.2c |
| 24 | 119.1a | 4.3 | 14.0 | 16.0 | 34ab | 0.0b | 2.5ab | 25.2a | 81.3ab |
| 38 | 102.3ab | 4.4 | 12.5 | 18.0 | 28bcd | 0.0b | 2.3bc | 24.6a | 79.9b |
| 39 | 96.4b | 4.3 | 13.5 | 18.0 | 30bc | 0.0b | 2.3bc | 22.1c | 80.9b |
| 64 | 95.5b | 4.1 | 13.1 | 14.0 | 30bc | 0.5b | 2.0c | 24.0b | 81.8ab |
Note: Diffeerent lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same below
注：不同小写字母表示在0.05水平下差异显著。下同
进一步考察6个中选改良系的株型性状。株型性状方差分析（表7）结果显示,基因型对株高、穗位高及叶夹角影响达极显著差异水平,其他均无显著差异。
表7 6个昌7-2糯质改良家系及供体、轮回亲本株型性状方差分析
Table 7
| 变异来源Variation source | 株高Plant height | 穗位高Ear height | 雄穗长Tassel length | 雄穗分枝数Tassel branch number | 叶夹角Leaf angle |
|---|---|---|---|---|---|
| 基因型Genotype | 243.68** | 157.85** | 12.25 | 27.86 | 28.85** |
| 重复Repeat | 6.25 | 0.56 | 2.25 | 0.25 | 14.06 |
| 误差Error | 19.39 | 5.71 | 3.96 | 11.68 | 2.78 |
由表8可以看出,改良系11、18、24、39和64在株高、穗位高、雄穗长、雄穗分枝数和叶夹角5个株型性状与轮回亲本昌7-2均无显著差异。6个改良系的株高和穗位高均显著高于供体亲本云539,且叶夹角均显著低于云539。可见,在株型上,改良系与昌7-2相似,而与亲本云539普遍存在较大差异。
表8 6个昌7-2糯质改良家系及供体、轮回亲本株型性状表现
Table 8
| 编号 Number | 株高 Plant height (cm) | 穗位高 Ear height (cm) | 雄穗长 Tassel length (cm) | 雄穗分枝数 Tassel branch number | 叶夹角 Leaf angle (°) |
|---|---|---|---|---|---|
| 云539 Yun 539 | 155.4b | 62.2b | 29.3 | 9.3 | 29.0a |
| 昌7-2 Chang 7-2 | 185.4a | 87.3a | 22.2 | 19.3 | 21.0cd |
| 11 | 184.0a | 88.5a | 23.3 | 18.2 | 18.5d |
| 18 | 189.2a | 88.2a | 23.3 | 21.3 | 19.5cd |
| 24 | 186.3a | 87.4a | 22.1 | 19.4 | 17.0d |
| 38 | 188.3a | 87.3a | 22.3 | 19.2 | 24.5b |
| 39 | 185.3a | 87.5a | 23.4 | 17.2 | 23.0cd |
| 64 | 183.1a | 83.0a | 21.1 | 20.1 | 21.0cd |
3 讨论
我国糯玉米的wx基因的遗传多样性很低,主要存在wx-D7和wx-D10 2种突变类型,占96.9%[28]。
Fan等[29]报道了2种中国糯玉米wx-D7(D7)和wx-D10(D10)突变的具体情况。wx-D7是wx基因的外显子7尾端30bp的缺失（包括第7外显子的3′端4bp和第7内含子的5′端26bp）,在该位点转录剪切失效,剩余的第7内含子均保留在转录本中,使得终止子TAA提早出现而导致翻译提前中断,GBSSI蛋白功能缺失。wx-D10是wx的第10外显子内部发生15bp的缺失,该位点是糖基转移酶（glucosyl transferase domain 1,GTD1）功能域的关键序列。本研究所得到的云539的wx基因属于wx-D7(D7)类型的突变。
分子标记辅助选择可避免环境条件的干扰,直接对胚乳突变基因型进行选择,提高育种效率[22]。但是,一方面由于分子标记与目的基因之间的连锁不够紧密,遗传交换在所难免,选择效率常低于预期;另一方面,作物育种中常用的分子标记大多位于基因间非表达序列,一般无法区别与其连锁基因的表达序列差异,而这种差异才是决定育种材料间目标性状差异的主要原因。因此,根据所选择的目的基因序列差异,开发基因内选择标记或称功能标记,对单基因以及主效多基因的选择将更为有效[21]。功能标记的应用可以更好地避免连锁累赘,减少供体不利基因向受体导入。本研究根据wx等位基因的序列差异开发的功能标记既克服了杂交和回交育种中隐性基因表型选择困难的问题,又避免了普通分子标记辅助选择中遗传交换对选择效果的影响,可对种子直接选择,淘汰不携带隐性糯质基因的单株,将随后的选择集中于其他农艺性状,对我国糯玉米品质育种和种质创新具有重要意义。
4 结论
以糯玉米自交系云539和普通玉米自交系昌7-2为材料,通过DNA序列测定和分析,探明了糯玉米自交系云539的wx基因突变类型属于我国糯玉米种质资源典型的wx-D7突变类型,并开发出waxy基因功能标记FMD7。利用开发的基因功能标记FMD7进行分子标记辅助选择,结合产量、株型和品质性状分析,获得6个携带wx基因的优良昌7-2改良系。
参考文献
Molecular analysis of the waxy locus of Zea mays
The enzymatic deficiency in the waxy mutant of maize
The amylose extender mutant of maize conditions novel protein-protein interactions between starch biosynthetic enzymes in amyloplasts
Excision of Ds produces waxy proteins with a range of enzymatic activities
Economic impact of marker-assisted selection and rapid generation advance on breeding programs
Marker-assisted selection to pyramid the opaque-2 (O2) and β-Carotene (crtRB1) genes in maize
Marker assisted selection in crop plants
Irish medicine's appeal to Rockefeller. 1920s
IRS-bubble PCR:an effective method for representative amplification of human genomic DNA sequences from complex sources
Molecular genetic analysis of recessive mutations at a heterozygous autosomal locus in human cells
Common founder effect of rapsyn N88K studied using intragenic markers
Genome analysis at different ploidy levels allows cloning of the powdery mildew resistance gene Pm3b from hexaploid wheat
Development of functional markers specific for seven Pm3 resistance alleles and their validation in the bread wheat gene pool
Extraction of high-quality genomic DNA from different plant orders applying a modified CTAB-based method.
Molecular evidence for post-domestication selection in the waxy gene of Chinese waxy maize
