山东水稻属华北单季稻作带,是重要的高产高效作物和生态作物,种植历史悠久。1949年以来,山东水稻品种大致经过4次大的更新[1]。1949-1959年初种植紫皮旱稻和竹竿青等地方品种;1960-1979年主要种植引进的农垦57、桂花黄、农垦39和农垦40等品种;1980-1999年为引种和育种结合时期,主要种植金南风、京引119和日本晴等引进品种和鲁粳1号、临稻1号、临稻2号、鱼农1号和鲁香粳2号等自育品种;2000年至今种植自主选育品种,前期主要种植临稻10号、临稻11、圣稻301、香粳9407、阳光200和圣稻13等品种,近年来主要种植圣稻18、圣稻19、临稻16和润农11等品种。自20世纪90年代以来,山东省培育了一批水稻品种,这些品种无论是从产量还是抗性上,都较以前种植品种有了很大的提高。但目前在水稻育种工作中存在过分倚重核心亲本,造成品种遗传基础狭窄、同质化现象严重。因此,利用遗传多样性分析育种材料的遗传背景和亲缘关系,可拓宽水稻亲本的遗传基础,为合理利用优异亲本和培育新品种提供帮助,对种质创新和新品种选育具有重要意义。
SSR标记具有简便、稳定、多态性高和成本低等优点,是目前在水稻种质资源遗传多样性研究中应用最广泛的分子标记,已被广泛应用于评价水稻的遗传多样性和亲缘关系。应用SSR标记技术对不同来源和年代育成的水稻品种资源进行遗传多样性研究的报道很多。赵庆勇等[2]用64对SSR引物对江苏省育成以及引进的30个粳稻品种进行遗传多样性分析,结果表明江苏省育成的品种遗传多样性不够丰富,多数品种间亲缘关系较近。张燕红等[3]利用63对引物对新疆维吾尔自治区育成品种及引进资源进行遗传多样性分析,发现育成品种的遗传背景相似性较高、多样性不够丰富。李小华等[4]利用12对SSR引物对浙江省育成的46个常规粳稻品种进行了遗传多样性分析和指纹图谱构建。刘丹等[5]利用45对SSR引物对黑龙江省不同育种单位育成的粳稻资源进行了遗传多样性分析。韩迎春等[6]对河南省粳稻品种进行SSR指纹图谱构建及遗传差异分析的研究表明,推广的品种遗传基础较为狭窄。
水稻品种的遗传多样性决定着育种的发展前景[7]。育种工作成效的大小很大程度上取决于所掌握种质材料的数量及对其性状表现的深入了解,通过遗传背景分析可以进一步了解水稻品种间的亲缘关系,所以,为培育更多优质的水稻新品种,有必要对山东省近年来育成和审定水稻品种的遗传多样性进行分析,明确其遗传差异程度。SSR标记可以进一步了解水稻品种间的遗传距离和亲缘关系,避免仅依据表型选择亲本,减少育种工作中亲本选配的盲目性,从而提高育种效率。
因此,本研究选取山东省近年来审定和育成的48个水稻品种（系）,利用48对SSR引物对其进行遗传多样性分析,探讨品种（系）间的亲缘关系及其变化趋势,为更有效地开展水稻育种提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
选取48个自2002年以来通过山东省审定和完成生产试验的水稻品种（系）及山东省育种单位育成的国审水稻品种（系）作为试验材料,于2018年种植于山东省水稻研究所济宁试验基地。材料的名称和来源见表1。
表1 供试水稻品种（系）的名称和来源
Table 1
| 编号 Number | 品种（系） Variety (line) | 来源 Origin | 编号 Number | 品种（系） Variety (line) | 来源 Origin | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 圣稻13 Shengdao 13 | 山东省水稻研究所 | 25 | 大粮203 Daliang 203 | 临沂市大粮种业有限公司 | |
| 2 | 圣稻14 Shengdao 14 | 山东省水稻研究所 | 26 | 大粮207 Daliang 207 | 临沂市大粮种业有限公司 | |
| 3 | 圣稻15 Shengdao 15 | 山东省水稻研究所 | 27 | 润农303 Runnong 303 | 临沂市大粮种业有限公司 | |
| 4 | 圣稻16 Shengdao 16 | 山东省水稻研究所 | 28 | 大粮306 Daliang 306 | 临沂市大粮种业有限公司 | |
| 5 | 圣稻17 Shengdao 17 | 山东省水稻研究所 | 29 | 阳光600 Yangguang 600 | 郯城县种子公司 | |
| 6 | 圣稻18 Shengdao 18 | 山东省水稻研究所 | 30 | 阳光800 Yangguang 800 | 郯城县种子公司 | |
| 7 | 圣稻19 Shengdao 19 | 山东省水稻研究所 | 31 | 阳光900 Yangguang 900 | 郯城县种子公司 | |
| 8 | 圣稻20 Shengdao 20 | 山东省水稻研究所 | 32 | 阳光958 Yangguang 958 | 郯城县种子公司 | |
| 9 | 圣稻22 Shengdao 22 | 山东省水稻研究所 | 33 | 润农4号 Runnong 4 | 山东润农种业科技有限公司 | |
| 10 | 圣稻23 Shengdao 23 | 山东省水稻研究所 | 34 | 润农早粳1号 Runnongzaojing 1 | 山东润农种业科技有限公司 | |
| 11 | 圣稻24 Shengdao 24 | 山东省水稻研究所 | 35 | 润农11 Runnong 11 | 山东润农种业科技有限公司 | |
| 12 | 圣稻25 Shengdao 25 | 山东省水稻研究所 | 36 | 丰稻4号 Fengdao 4 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | |
| 13 | 圣稻26 Shengdao 26 | 山东省水稻研究所 | 37 | 临稻10 Lindao 10 | 临沂市水稻研究所 | |
| 14 | 圣糯139 Shengnuo 139 | 山东省水稻研究所 | 38 | 临稻15 Lindao 15 | 临沂市水稻研究所 | |
| 15 | 圣香136 Shengxiang 136 | 山东省水稻研究所 | 39 | 临稻16 Lindao 16 | 沂南县水稻研究所 | |
| 16 | 圣稻2572 Shengdao 2572 | 山东省水稻研究所 | 40 | 临稻18 Lindao 18 | 沂南县水稻研究所 | |
| 17 | 圣稻27 Shengdao 27 | 山东省水稻研究所 | 41 | 临稻19号 Lindao 19 | 临沂市水稻研究所 | |
| 18 | 圣稻1722 Shengdao 1722 | 山东省水稻研究所 | 42 | 临稻20 Lindao 20 | 沂南县水稻研究所 | |
| 19 | 圣稻3466 Shengdao 3466 | 山东省水稻研究所 | 43 | 临稻21号 Lindao 21 | 临沂市农业科学院 | |
| 20 | 香粳9407 Xiangjing 9407 | 山东省水稻研究所 | 44 | 临稻22 Lindao 22 | 临沂市农业科学院 | |
| 21 | 圣稻28 Shengdao 28 | 山东省水稻研究所 | 45 | 临稻23号 Lindao 23 | 临沂市农业科学院 | |
| 22 | 圣香66 Shengxiang 66 | 山东省水稻研究所 | 46 | 垦稻88 Kendao 88 | 河北省农林科学院滨海农业研究所/ 郯城精华种业 | |
| 23 | 圣香糯1号 Shengxiangnuo 1 | 山东省水稻研究所 | 47 | 南粳505 Nanjing 505 | 江苏省农业科学院粮食作物研究所/ 山东省水稻研究所 | |
| 24 | 圣武糯0146 Shengwunuo 0146 | 山东省水稻研究所/ 江苏武进稻麦育种场 | 48 | 圣糯1号 Shengnuo 1 | 山东省水稻研究所 |
1.2 供试SSR引物
所用引物为农业行业标准《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法（NY/T 1433-2014）》中公布的48对SSR引物。荧光引物由上海生工生物技术有限公司合成,正向引物加注FAM（蓝）的荧光染料。
1.3 基因组DNA的提取、纯化和检测
采用CTAB结合Glass Milk法提取基因组DNA,使用Merinton SMA 1000 Nanodrop分光光度计检测DNA浓度及纯度,保证OD260/OD280值≥1.8,浓度≥20ng/μL,同时分别取2μL进行琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性。
1.4 PCR扩增与产物多重荧光检测
采用25.0μL的PCR扩增反应体系,其中10×PCR Buffer（含2mmol/L Mg2+）2.5μL、2.5mmol/L dNTP 2.0μL、5U Taq DNA聚合酶0.2μL、5μmol/L正反向引物各1.0μL、DNA模板2.0μL和超纯水16.3μL。取20μL ROX500内标加入980μL去离子甲酰胺中,涡旋混匀,离心,按10μL/孔分装至新的96孔板内,取1~2μL PCR产物对应地加入各孔中,3000转/min离心1min;于PCR仪上95℃变性5min,立即置于冰上。在ABI 3730XL DNA测序仪上进行荧光毛细管电泳;50cm毛细管,使用POP 7液体分离胶,15kV预电泳18s,待毛细管洗涤完毕后,15kV电泳28min。使用DNA Collection Software软件收集原始数据。引物、荧光标记、Taq DNA聚合酶和dNTP等试剂购自上海生工生物技术有限公司,POP 7液体分离胶购自美国应用生物系统（Applied Biosystems）中国代理公司。
1.5 数据统计和分析
利用Gene Mapper V3.2进行图像分析与数据收集。利用Power Marker V3.25分析统计每对引物的等位基因数、基因型数、等位基因频率和多态性信息量（PIC）,标记指数（marker index,MI）按公式MI=Allele×PIC计算,式中Allele为该引物的等位基因数。应用统计分析软件NTSYS 2.10[8]以共有片段比例（软件中coefficient参数选择SM）为指标计算材料之间的遗传相似性系数（genetic similarity coefficient,GSC）。根据GSC,通过NTSYS 2.10用非加权类平均法（UPGMA）进行聚类分析,并绘制成树状图。
2 结果与分析
2.1 SSR标记多态性分析
结果（表2）表明,所用48对引物中RM71、RM85、RM119、RM267、RM274、RM278、RM424和RM443 8个引物在供试的48个品种（系）中未检测到多态性位点;其余40对引物在供试的48个品种（系）中能够检测到多态性位点,占所用引物的83.3%,共检测到133个等位基因,SSR引物等位基因数变异范围为1~7个,平均值为3.32。RM336检测到的等位基因数最多,为7个。多态性信息量（PIC）是等位基因数和频率的函数,具有较高PIC值的SSR标记具有较高的检测效率,SSR位点的PIC平均值为0.2560,变幅范围为0.0384~0.7333,RM336的PIC值最高,为0.7333。各SSR引物的MI变化范围在0.08~5.13,平均值为0.93。
表2 SSR引物、染色体位置、基因多样性、等位基因数、PIC值和MI
Table 2
| 引物 Primer | 染色体 Chromosome | 基因多样性 Gene diversity | 等位基因数 Number of alleles | PIC值 PIC value | 标记 指数 MI |
|---|---|---|---|---|---|
| OSR28 | 9 | 0.56 | 4 | 0.4723 | 1.89 |
| RM17 | 12 | 0.18 | 3 | 0.1722 | 0.52 |
| RM19 | 12 | 0.44 | 2 | 0.3444 | 0.69 |
| RM21 | 11 | 0.45 | 6 | 0.4249 | 2.55 |
| RM71 | 2 | 0.00 | 1 | 0.0000 | 0.00 |
| RM72 | 8 | 0.46 | 5 | 0.3994 | 2.00 |
| RM85 | 3 | 0.00 | 1 | 0.0000 | 0.00 |
| RM119 | 4 | 0.00 | 1 | 0.0000 | 0.00 |
| RM176 | 6 | 0.08 | 2 | 0.0739 | 0.15 |
| RM190 | 6 | 0.11 | 2 | 0.1064 | 0.21 |
| RM208 | 2 | 0.57 | 3 | 0.4750 | 1.42 |
| RM209 | 11 | 0.67 | 4 | 0.5985 | 2.39 |
| RM219 | 9 | 0.34 | 4 | 0.3216 | 1.29 |
| RM224 | 11 | 0.57 | 3 | 0.5007 | 1.50 |
| RM231 | 3 | 0.47 | 3 | 0.3927 | 1.18 |
| RM232 | 3 | 0.28 | 4 | 0.2654 | 1.06 |
| RM253 | 6 | 0.38 | 2 | 0.3047 | 0.61 |
| RM258 | 10 | 0.04 | 2 | 0.0384 | 0.08 |
| RM267 | 5 | 0.00 | 1 | 0.0000 | 0.00 |
| RM274 | 5 | 0.00 | 1 | 0.0000 | 0.00 |
| RM278 | 9 | 0.00 | 1 | 0.0000 | 0.00 |
| RM289 | 5 | 0.11 | 2 | 0.1064 | 0.21 |
| RM311 | 10 | 0.24 | 5 | 0.2308 | 1.15 |
| RM316 | 9 | 0.49 | 2 | 0.3685 | 0.74 |
| RM331 | 8 | 0.45 | 3 | 0.3679 | 1.10 |
| RM332 | 11 | 0.42 | 3 | 0.3806 | 1.14 |
| RM336 | 7 | 0.77 | 7 | 0.7333 | 5.13 |
| RM339 | 8 | 0.04 | 2 | 0.0384 | 0.08 |
| RM481 | 7 | 0.13 | 4 | 0.1294 | 0.52 |
| RM423 | 2 | 0.11 | 2 | 0.1064 | 0.21 |
| RM424 | 2 | 0.00 | 1 | 0.0000 | 0.00 |
| RM432 | 7 | 0.42 | 2 | 0.3318 | 0.66 |
| RM443 | 1 | 0.00 | 1 | 0.0000 | 0.00 |
| RM471 | 4 | 0.32 | 2 | 0.2688 | 0.54 |
| RM490 | 1 | 0.44 | 4 | 0.3917 | 1.57 |
| RM493 | 1 | 0.11 | 2 | 0.1064 | 0.21 |
| RM542 | 7 | 0.59 | 4 | 0.4996 | 2.00 |
| RM551 | 4 | 0.54 | 3 | 0.4300 | 1.29 |
| RM561 | 2 | 0.57 | 3 | 0.4824 | 1.45 |
| RM567 | 4 | 0.67 | 4 | 0.5955 | 2.38 |
| RM571 | 3 | 0.04 | 2 | 0.0384 | 0.08 |
| RM583 | 1 | 0.62 | 6 | 0.5816 | 3.49 |
| RM590 | 10 | 0.04 | 2 | 0.0384 | 0.08 |
| RM598 | 5 | 0.04 | 2 | 0.0384 | 0.08 |
| RM1195 | 1 | 0.57 | 4 | 0.5127 | 2.05 |
| RM3331 | 12 | 0.45 | 2 | 0.3481 | 0.70 |
| RM7102 | 12 | 0.27 | 2 | 0.2327 | 0.47 |
| RM8277 | 3 | 0.04 | 2 | 0.0384 | 0.08 |
| 平均Mean | - | 0.29 | 3.32 | 0.2560 | 0.93 |
2.2 48个粳稻品种（系）的遗传相似性分析
根据供试引物在48份供试品种（系）中所获得的133个等位基因,按NTSYS 2.10统计分析软件计算GSC。48个水稻品种（系）的GSC在0.6390~0.9859之间,平均值为0.7800。其中,临稻10（临89-27-1/日本晴）和大粮203（临稻10/焦选D2）、临稻10和临稻23（临稻10/盐粳7号）、临稻23和临稻21（临稻10/镇稻88）、圣稻17（圣稻13/圣稻15）与圣稻20（圣稻13/圣稻15）4组品种（系）间的GSC最大,均为0.9859。根据系谱来看,大粮203、临稻21和临稻23均是以临稻10号为亲本选育而来,圣稻17与圣稻20均是以相同组合选育而来,这些品种（系）的遗传背景极为相近;圣稻14和临稻15、圣稻1722与临稻16 2组品种（系）间的GSC最小,为0.6390。根据计算所得的1185个GSC,以0.02为组距进行次数分布分析,由图1可知,供试材料的GSC次数呈正态分布。GSC在0.7189~0.9859之间的数量为1062个,占整个数据的89.6%;0.8189~0.9859之间的有370个,占总数的31.2%,说明山东省育成的水稻品种（系）间遗传相似性高,遗传差异较大的品种（系）数量少。
图1
2.3 基于SSR分析的聚类结果
由图2可知,供试品种（系）在GSC 0.75处可以被区分为4个类群,类群I包含圣稻20、圣稻17等在内的28个品种（系）;类群II包含丰稻4号、阳光958等在内的18个品种（系）;类群III和类群IV分别只含有1个品种（系）,分别为临稻20和圣香136。类群I和类群II内品种（系）的GSC高,例如临稻10和大粮203等,GSC达到0.9850,这些品种（系）在田间也表现出一定的相似性,与聚类分析结果相吻合;类群III和类群IV的各1个品种（系）独立成群,与其他品种（系）的GSC为0.7200左右,说明与其他品种（系）的亲缘关系较远。以上结果表明,山东省近年育成的品种（系）之间整体遗传相似程度较高,品种（系）资源亲缘关系较近,遗传多样性较低。
图2
图2
48个水稻品种（系）的遗传相似性聚类图
Fig.2
Dendrogram of 48 rice varieties (lines) based on GSC
3 讨论
3.1 SSR标记
本研究所用的48对SSR引物覆盖了水稻12条染色体,每条3~5个等位基因。利用所选标记对48个水稻品种（系）进行遗传多样性分析,共检测到133个等位基因,每对引物检测到1~7个等位基因。李小华等[4]用12对SSR引物分析了46个浙江省粳稻品种的遗传多样性,共检测出84个等位基因,平均7个。张燕红等[3]用63对引物分析新疆粳稻种质资源,共检测到388个有效等位基因,平均每对引物6.158个等位基因;何宇涵等[9]用13对引物分析22份河南省粳稻资源共检测出40个等位基因,每个位点平均3.1个等位基因;徐大勇等[10]用33对多态性引物在136个粳稻品种中共检测出106个等位基因,每个位点平均等位基因数为3.2个;孙健等[11]用42对SSR标记分析黑龙江省主栽品种,检测到等位基因数平均为3.31个。本试验中的40对多态性引物平均每个位点检测出等位基因数为3.32个,该结果与河南省粳稻资源[9]、黄淮稻区[10]和黑龙江省[11]研究结果相似,但稍低于46个浙江省粳稻品种[4]和新疆种质资源[3],可能与选取的SSR标记和试验材料不同有关。供试引物的PIC平均值为0.2560,变幅范围为0.0384~0.7333,RM336、RM583、RM567和RM209等引物的PIC值较高,这些引物可以用于山东省育成品种的指纹图谱构建和种子纯度的鉴定。
3.2 供试品种（系）亲缘关系
本研究供试品种（系）间的GSC变化范围在0.6390~0.9850之间,89.6%品种（系）的GSC在0.7189~0.9859之间,表明近年来山东省育成的水稻品种（系）总体上遗传相似性高,多数品种（系）间遗传背景比较单一,大部分品种（系）间的遗传距离小。不仅是山东省,甚至是全国稻区都存在品种遗传基础不够广泛的现象。王胜军等[12]比较分析了1981-2002年杂交籼稻主要亲本,认为其遗传基础狭窄、背景单一;杨静等[13]对黑龙江省育成的及日本引进的54个水稻品种进行遗传多样性分析,结果表明绝大多数供试品种的亲缘关系都很近;赵庆勇等[2]、张燕红等[3]、李小华等[4]、李云海等[14]、肖小余等[15]和蒋晓英等[16]也分别从DNA水平推断了我国部分杂交稻或者常规稻品种的遗传背景比较单一,迄今已利用的遗传资源的遗传基础较狭窄。
根据树状聚类图,本研究选取的水稻品种（系）主要分为2大类,类群Ⅰ包含圣稻20、圣稻17、圣稻27、临稻15、临稻22等28个品种（系）,系谱分析表明,这28个品种（系）中大部分是以镇稻88、临稻10号等为主要亲本直接或者衍生育成的品种（系）,类群Ⅱ包含圣稻18、圣稻19、圣稻22、圣稻25、圣稻3466等18个品种（系）,其中除阳光600外全部为直穗型品种（系）,系谱分析发现这一大类品种（系）是在圣稻301、镇稻88等山东省原有主要种植品种（系）基础上为了改进遗传基础狭窄等问题,利用引进的直穗型“太湖粳”育成的一系列品种（系）[17],其中水稻品种阳光600组合为镇稻88/旭梦,按系谱来看应该归为类群Ⅰ中,可能在试验过程中取错种子或者叶片造成的。山东省水稻育种目前利用的资源主要来自江苏省、天津市等相邻生态区,东北粳稻和引进粳稻应用很少且效果不佳,这可能是山东省育成品种（系）遗传相似性高的主要原因。因此,在今后的育种工作中应注意利用遗传差异大的资源,如引进籼稻、国外水稻资源等,不断拓展遗传基础,进一步提高品种的产量、品质和抗性。
4 结论
48个山东审定/育成水稻品种（系）的遗传相似系数在0.6390~0.9859之间,89.6％的品种（系）遗传相似系数在0.7189~0.9859之间,品种（系）的遗传多样性不够丰富,亲缘关系较近,在下一步的育种工作中,需进一步拓宽亲本选择范围,扩大遗传信息。
