对于雌雄异株工业大麻来说,大麻的雌雄植株的功能有所不同,一般来说,大麻雄性植株的纤维质量高于雌性植株,雄性植株可为纺织厂或造纸厂提供更好的纤维材料,就成熟期而言,雄性植株较雌性植株先成熟,不便于机械化收割[5,6,7]。另一方面,雌性植株可以收获种子,在医药、人类食品、动物饲料和身体护理产品等方面得到应用[7];且有研究认为雌性植株中THC和大麻二酚（CBD）含量相对较高[8],具有更高的药用价值。大麻雌雄株在幼苗时期较难分辨,只有当植株生殖器官（即花器官）原基开始发育时才能正确识别,所以最好的解决办法之一就是可以早期鉴定出雌雄株,以便于充分利用其经济价值[9]。工业大麻良种繁育时,为了收获种子,减少雄株率,可以通过早期性别鉴定选择雌雄株比例。杂交育种选择雌雄异株材料作为亲本时,也可通过早期性别鉴定选择需要的材料。
因此,亟待对工业大麻性别分化及分子遗传机理进行深入研究,为工业大麻早期性别鉴定及其性别表达和调控的分子机制研究奠定理论基础。利用RAPD（随机扩增多态性DNA）分子标记技术研究工业大麻性别连锁特异标记,为工业大麻早期性别鉴定提供基础,且为减少雌雄同株工业大麻材料的雄化提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验选用雌雄异株工业大麻品种“火麻一号”（以下用HM1表示）进行RAPD和SCAR标记的筛选;鉴定方面选用的资源材料有：雌雄异株材料,花期取样的6个材料HM1、SH2（黑龙江省地方品种绥化-2）、WD2（皖大麻2号）、LJ（黑龙江省地方品种龙江）、BQ（黑龙江省地方品种拜泉）、LB（山西省地方品种绿宝）的雌株和雄株;苗期随机取样的2个材料QM1（庆大麻1号）、JM1（吉林省地方品种柳河大麻）;1个雌雄同株材料USO-14;所有材料均由黑龙江省科学院大庆分院亚麻综合利用研究所提供。
1.2 工业大麻性别的RAPD分子标记
2017年将HM1的种子播种于黑龙江省春雷农场温室中,常规田间种植管理;2018年于HM1花期分别取雌株和雄株的幼嫩叶片,在黑龙江省科学院大庆分院麻类作物实验室,利用优化的SDS法[12]提取基因组DNA。然后,取10株雄性植株大麻的单个DNA样品进行等量混合组成雄性DNA池;取10株雌性植株大麻的单个DNA样品进行等量混合组成雌性DNA池,-20℃保存备用。
表1 RAPD随机引物及核苷酸序列（5′-3′）
Table 1
| 引物Primer | 序列Sequence | 引物Primer | 序列Sequence | 引物Primer | 序列Sequence | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| OPH-18 | GAATCGGCCA | OPP-08 | ACATCGCCCA | OPZ-06 | GTGCCGTTCA | ||
| OPI-07 | CAGCGACAAG | OPP-11 | AACGCGTCGG | OPZ-13 | GACTAAGCCC | ||
| OPO-10 | TCAGAGCGCC | OPP-12 | AAGGGCGAGT | OPU-05 | TTGGCGGCCT | ||
| OPO-12 | CAGTGCTGTG | OPP-15 | GGAAGCCAAC | OPU-12 | TCACCAGCCA | ||
| OPO-15 | TGGCGTCCTT | OPP-16 | CCAAGCTGCC | OPU-15 | ACGGGCCAGT | ||
| OPY-05 | GGCTGCGACA | OPP-17 | TGACCCGCCT | OPU-16 | CTGCGCTGGA | ||
| OPY-11 | AGACGATGGG | OPS-11 | AGTCGGGTGG | OPR-08 | CCCGTTGCCT | ||
| OPY-15 | AGTCGCCCTT | OPS-17 | TGGGGACCAC | OPR-12 | ACAGGTGCGT | ||
| OPY-16 | GGGCCAATGT | OPS-19 | GAGTCAGCAG | OPR-13 | GGACGACAAG | ||
| OPT-07 | GGCAGGCTGT | OPX-12 | TCGCCAGCCA | OPV-06 | ACGCCCAGGT | ||
| OPT-08 | AACGGCGACA | OPX-13 | ACGGGAGCAA | OPV-07 | GAAGCCAGCC | ||
| OPT-13 | AGGACTGCCA | OPX-17 | GACACGGACC | OPV-08 | GGACGGCGTT | ||
| OPQ-05 | CCGCGTCTTG | OPW-09 | GTGACCGAGT | OPV-10 | GGACCTGCGT | ||
| OPQ-12 | AGTAGGGCAC | OPW-16 | CAGCCTACCA | OPV-17 | ACCGGCTTGT |
1.3 工业大麻特异DNA片段胶回收产物测序
利用上海生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收特异片段,样品用封口膜密封后送于上海生工生物工程股份有限公司进行DNA测序。
1.4 特异性引物设计及SCAR分子标记
根据DNA测序结果设计特异性引物OPV-08F：5′-GGACGGCGTTCCAAACGA-3′,OPV-08R：5′-GGACGGCGTTGGTTGAAATG-3′。
提取鉴定方面所用材料的基因组DNA,并以DNA为模板进行PCR扩增。反应体系总体积为25.0µL,其中ddH2O为10.5µL,2×Taq Master Mix（ProbeGene公司）为12.5µL,DNA为1.0µL,OPV-08F为0.5µL,OPV-08R为0.5µL。反应条件为94℃预变性3min;94℃变性1min;36℃复性1min;72℃延伸2min;共进行35个循环;再72℃延伸5min;反应结束后保存于4℃。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。
2 结果与分析
2.1 DNA的提取
图1
图1
DNA提取
M,分子量标准1kb plus;1~2,HM1的雌株;3~4,HM1的雄株;5,SH2的雌株;6,SH2的雄株;7,WD2的雌株;8,WD2的雄株;9,LJ的雌株;10,LJ的雄株;11,BQ的雌株;12,BQ的雄株;13,LB的雌株;14,LB的雄株;15~16,苗期QM1的叶片;17~18,苗期JM1的叶片;19,雌雄同株材料USO-14
Fig.1
DNA extraction in industrial hemp
M, DNA marker is 1kb plus DNA ladder; 1-2, The female of HM1; 3-4, The male of HM1; 5, The female of SH2; 6, The male of SH2; 7, The female of WD2; 8, The male of WD2; 9, The female of LJ; 10, The male of LJ; 11, The female of BQ; 12, The male of BQ; 13, The female of LB; 14, The male of LB; 15-16, The leaves of QM1 at seedling stage; 17-18, The leaves of JM1 at seedling stage; 19, Monoecism industrial hemp USO-14
2.2 工业大麻性别的RAPD分子标记
以HM1的雌雄株DNA池为模板,分别用上述42条RAPD引物进行PCR扩增,扩增产物经电泳后进行分析筛选。结果发现,引物OPV-08（5′-GGACGGCGTT-3′）在雄性工业大麻植株中扩增出1条>750bp的特异性条带,条带明显,且稳定性高（图2）。
图2
图2
引物OPV-08对工业大麻HM1雌雄株DNA池的PCR扩增结果
箭头表示在>750bp处有雄性特异片段;分子量标准D2000 DNA ladder
Fig.2
PCR amplification with the DNA pools of female and male plants in industrial hemp HM1 using primer OPV-08
Arrow indicate that there is a male specific fragment at>750bp; DNA marker is D2000 DNA ladder
2.3 工业大麻雄性特异DNA片段胶回收产物及测序结果
2.3.1 工业大麻雄性特异DNA片段胶回收产物 采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收雄性特异片段,并用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,回收条带清晰（图3）,无杂质,可用于DNA测序。
图3
2.3.2 雄性特异片段测序结果 将PCR胶回收产物送于上海生工生物工程股份有限公司进行DNA测序,得到相关序列并进行分析,通过DNAMAN进行序列分析显示该雄性特异片段共869bp,属于非编码序列。EditSeq软件分析发现其碱基组成为：A 26.18%、G 24.57%、T 26.76%、C 22.49%（图4）。
图4
2.4 工业大麻性别的SCAR分子标记开发与鉴定
2.4.1 OPV-08特异片段的SCAR分子标记引物设计及检测 为了将工业大麻雄性的RAPD分子标记转化为更加稳定的SCAR分子标记,根据随机引物OPV-08扩增得到的雄性特异片段的序列分别设计18和20个碱基的正反向引物,正向引物的序列为5′-GGACGGCGTTCCAAACGA-3′;反向引物的序列为5′-GGACGGCGTTGGTTGAAATG-3′。用这两条正反向引物对HM1不同性别植株的DNA进行PCR扩增,得到了一条雄性SCAR分子标记（图5）。
图5
图5
HM1雄性的SCAR分子标记
分子量标准D2000 DNA ladder
Fig.5
SCAR molecular markers of HM1 male
DNA marker is D2000 DNA ladder
2.4.2 SCAR分子标记检测花期雌雄异株工业大麻性别 为了验证在工业大麻品种HM1中所获得的SCAR分子标记也适用于其他雌雄异株品种的雌雄株,用该标记检测包含HM1在内的6个已知雌雄株的雌雄异株工业大麻（图6）,结果表明,此SCAR分子标记同样可以应用到其他雌雄异株材料花期的性别鉴定。
图6
图6
SCAR分子标记对6个雌雄异株工业大麻的雌雄株检测结果
1~6分别为HM1、SH2、WD2、LJ、BQ、LB;分子量标准D2000 DNA ladder
Fig.6
Detection of male and female plants in six dioecious industrial hemp by SCAR molecular markers
1-6 are HM1, SH2, WD2, LJ, BQ, LB, respectively; DNA marker is D2000 DNA ladder
2.4.3 SCAR分子标记检测苗期雌雄异株工业大麻性别 为了验证在工业大麻品种HM1中所获得的SCAR分子标记同样也适用于苗期未知性别的大麻,用该标记检测工业大麻材料QM1和JM1,分别随机选取6株QM1、JM1的幼苗,提取DNA进行验证,结果（图7）表明,QM1材料中2、5为雄株,JM1材料中2、4、5为雄株,并经花期调查验证,所得结果与花期雌雄株分化结果一致,所以,获得的SCAR分子标记同样也适用于工业大麻的早期性别鉴定。
图7
图7
SCAR分子标记对2个雌雄异株工业大麻苗期的性别检测结果
分子量标准D2000 DNA ladder
Fig.7
Sex detection of dioecious industrial hemp at seedling stage by SCAR molecular markers
DNA marker is D2000 DNA ladder
2.4.4 SCAR分子标记在雌雄同株工业大麻上的分析 为了分析该SCAR分子标记在雌雄同株工业大麻上的应用,用该标记检测随机选取的5株雌雄同株材料USO-14叶片的DNA,结果表明,在>750bp处无条带（图8）,上述结果表明该SCAR分子标记可以作为雌雄同株材料雄化的早期鉴定,即可在现蕾期之前发现可能分化的雄株材料并提早去除,以提高雌雄同株率。
图8
图8
SCAR分子标记分析雌雄同株工业大麻
分子量标准D2000 DNA ladder
Fig.8
Analysis of SCAR molecular markers in monoecism industrial hemp
DNA marker is D2000 DNA ladder
3 结论与讨论
工业大麻的性别鉴定是工业、农业和医学应用中的一个重要问题,因为在实践中,雄性和雌性植株分别有着不同的作用[30]。国内外研究人员也将RAPD与SCAR分子标记技术应用于工业大麻的性别研究。Mandolino等[31]利用RAPD技术从大麻中获得一个400bp与雄性表型相关的标记。陈其军等[32]利用S401引物扩增得到长度约为2.5kb的雄性相关片段。Shao等[30]利用15个RAPD随机引物进行扩增,引物OPA-04和OPF-05扩增得到3个雌性相关片段。李仕金等[9]利用200条RAPD随机引物进行扩增,引物S208扩增得到一条大小为429bp与大麻雄性相关的特异条带。本研究以“火麻一号”为试验材料,利用RAPD与SCAR分子标记技术,由OPV-08扩增获得一条大小为869bp与工业大麻雄性相关的特异条带。经雌雄异株材料花期雌、雄单株验证,该条带只在雄性单株中稳定出现;经雌雄异株材料苗期随机取材进行验证,该条带也只在雄性单株中稳定出现;经雌雄同株材料验证,未发现该条带。由上述鉴定的结果可以得出,该条带只在雄株材料中特异表达,在雌株材料和雌雄同株材料中未出现该条带,且扩增结果表现为非特异表达。进一步表明本研究获得的雄性特异标记,不仅可以用来鉴定工业大麻开花后的植株,也可鉴定苗期性别未知的植株,这为工业大麻早期性别鉴定提供了理论基础,为减少雌雄同株材料的雄化提供了技术支撑。
参考文献
Hemp:Industrial Production and Uses
Key cultivation techniques for hemp in Europe and China
Effects and efficiency of dietary hemp seed and flaxseed oils on the human metabolic function
Taxonomic studies of Cannabis in China
大豆灰斑病抗病基因RAPD标记的分子特征及抗、感种质的SCAR标记鉴定
与大豆灰斑病抗病基因连锁的共显性标记OPS03620&580 的2个特征片段OPS03620 和OPS03580 的全序列分析表明 ,共显性分离的主要原因在于引物扩增区域内30bp的插入(或缺失) .Southern杂交显示 ,OPS03620 来源于大豆基因组中的单拷贝或低拷贝序列 ,可用作RFLP探针 .将RAPD标记转化成共显性的SCAR标记SCS3620&580 .用SCS3620&580 检测93株F2 群体所得结果与RAPD标记检测结果相同 ,对62份大豆灰斑病抗感种质资源的测试显示 ,在绝大部分抗、感种质之间存在明显多态性 .此标记兼具RFLP和RAPD的优点 ,在灰斑病抗病育种中具有广泛的应用价值.
A male and hermaphrodite specific RAPD marker for papaya (Carica papaya L.)
Development of SCAR markers based on RAPD and SRAP for rapid identification of pleurotus sajor-caju strain
Development of ISSR- and RAPD-derived SCAR markers for identification of gladiolus germplasm
Molecular sex identification in dioecious Hippophae rhamnoides L. via RAPD and SCAR markers
DOI:10.3390/molecules23051048 URL [本文引用: 1]
Female-associated DNA polymorphisms of hemp (Cannabis sativa L.)
Identification of DNA markers linked to the male sex in dioecious hemp (Cannabis sativa L.)
大麻性别的RAPD和SCAR分子标记
DOI:10.3321/j.issn:1671-3877.2001.02.014
URL
[本文引用: 1]
利用随机扩增多态性DNA (randomamplifiedpolymorphicDNA ,RAPD)技术获得与大麻性别连锁的分子标记。将 10株雄性大麻或 10株雌性大麻的单个DNA样品等量混合分别组成雄性或雌性DNA池(DNA pool) ,以提供具有相同遗传背景的雌、雄性DNA样品。每个随机引物分别用三个不同的循环程序进行PCR扩增。在 30个随机引物中 ,用引物S40 1扩增得到一条约 2 .5kb雄性多态性片段。对该片段进行了克隆和序列分析 ,并根据序列分析结果将上述RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)分子标记
