谷子角质合成基因对干旱胁迫的响应

doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2019.04.028

谷子角质合成基因对干旱胁迫的响应

岳琳祺, 施卫萍, 郭佳晖, 郭平毅, 郭杰

山西农业大学农学院,030801,山西晋中

Response of Cutin Synthetic Genes of Foxtail Millet to Drought Stress

Yue Linqi, Shi Weiping, Guo Jiahui, Guo Pingyi, Guo Jie

College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801, Shanxi, China

通讯作者: 郭平毅，教授，主要从事作物化学调控研究；郭杰，副教授，主要从事作物遗传育种研究

收稿日期: 2019-03-25 修回日期: 2019-06-13 网络出版日期: 2019-08-15

基金资助:

山西省重点研发计划项目(201803D221019-5,2015-TN-09)

Received: 2019-03-25 Revised: 2019-06-13 Online: 2019-08-15

作者简介 About authors

岳琳祺,在读硕士,主要从事谷子遗传育种研究。

摘要

干旱是影响谷子产量的重要因素,以抗旱性强的谷子品种赤谷16（M79）及其母本赤谷10号（E1）,父本承谷8号（H1）作为研究材料,采用苗期自然干旱处理并设置对照,在干旱处理第6天（土壤水分含量约为20%）时取叶片进行转录组测序。用ExPASY分析基因的理化性质,GSDS 2.0分析基因结构,MAGA 7.0构建系统进化树,TMHMM Server v. 2.0预测跨膜结构域,SOPMA预测蛋白的二级结构。结果显示8个谷子角质合成基因编码的蛋白均为亲水性蛋白,且均为酸性;经干旱胁迫处理之后,M79、E1和H1中8个基因的表达变化趋势有所不同,Seita.8G128800和Seita.7G197000表达明显上调;8个基因中有4个基因与玉米的基因具有同源性,有3个基因与水稻的基因具有同源性,编码蛋白部分有跨膜结构域。角质合成基因在谷子响应干旱胁迫过程中发挥作用,其调控机理较为复杂。本研究的结果为进一步探讨谷子角质与抗旱的关系提供了一定理论依据。

关键词： 谷子 ; 角质 ; 抗旱 ; 生物信息学分析

Abstract

Drought is an important influence factor on the yield of foxtail millet. The drought-resistant foxtail millet variety Chigu 16 (M79) and its female parent Chigu 10 (E1) and male parent Chenggu 8 (H1) were used as test materials in this study. Natural drought treatment at the seedling stage was adopted and a control was set up. Leaves were taken off on the 6th day of drought treatment (soil moisture content was about 20%) for transcriptome sequencing. The physiochemical properties of genes were analyzed on ExPASY, and gene structures were detected on GSDS 2.0. A phylogenetic tree was constructed on MAGA 7.0, the transmembrane domain was predicted on TMHMM Server v. 2.0 and the secondary structure of proteins was predicted using SOPMA. It was found that the proteins encoded by the 8 cutin synthetic genes of foxtail millets were all hydrophilic, and the 8 genes were all acidic. After the drought stress treatment, the expressions of the 8 genes changed in different trends among M79, E1 and H1, and Seita.8G128800 and Seita.7G197000 were significantly upregulated. Four of the eight genes were homologous with corn genes, three of the eight genes were homologous with rice genes, and a part of coding proteins had a transmembrane domain. The cutin synthetic genes play a role in the drought response of foxtail millet, but their regulation mechanism is complex. Our findings provide theoretically underlie for further exploration into the relationship between foxtail millet cutin and drought resistance.

Keywords： Foxtail millet ; Cutin ; Drought resistance ; Bioinformatics analysis

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本文引用格式

岳琳祺, 施卫萍, 郭佳晖, 郭平毅, 郭杰. 谷子角质合成基因对干旱胁迫的响应[J]. 作物杂志, 2019, 35(4): 183-190 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2019.04.028

Yue Linqi, Shi Weiping, Guo Jiahui, Guo Pingyi, Guo Jie. Response of Cutin Synthetic Genes of Foxtail Millet to Drought Stress[J]. Crops, 2019, 35(4): 183-190 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2019.04.028

谷子（Setaria italica L.）是华北地区重要的粮食作物,营养价值丰富。但是谷子长期种植于干旱半干旱地区,虽然拥有较好的光热条件,却因为降水量稀少影响谷子正常的生理生化反应,使得产量品质受到影响,制约了谷子产业的发展^[1]。因此研究谷子抗旱生理机制,挖掘抗旱相关基因,培育抗旱品种,在谷子生产中具有重要意义。此外,谷子具有较好的耐旱、耐贫瘠性,基因组小,重复序列少,可以作为新型模式作物进行研究^[2,3]。Qi等^[4]鉴定了2 824个具有干旱响应表达模式的基因,发现超过半数的基因上调表达,其中编码脱水素、热休克蛋白（HSP）、水通道蛋白和磷酯酶2C的基因数量最多。Muthamilarasan等^[5]发现谷子在受到干旱等非生物胁迫时,C2H2转录因子可以通过改变SiC2h2基因的表达模式参与相关调控路径,抵御非生物胁迫。窦祎凝等^[6]的研究表明基因SiNAC18可以通过参与ABA信号途径提高谷子在萌发期的抗旱性。此外,MYB、DREB、CBL等转录因子也被证实在谷子抗逆过程中发挥作用^{[7,8,9,10,11]}。

植物的角质层是覆盖在植物地上部分的一层疏水性物质,主要由长链脂肪酸及其衍生物组成^[12]。在植物进化的过程中,角质层的存在使得植物体内的水分不易散失,保证了陆生植物正常的生长发育过程^[13]。在水稻等作物中,已经发现了基因OsGL1、AtNCED通过调控角质的成分和生物合成途径达到抗旱的目的^[14,15]。王莎^[16]通过构建OsWR2-RNAi转基因植株,发现当水稻受到干旱胁迫时,转基因植株的表皮蜡质晶体密度和含量都有降低,从而验证了OsWR2对角质生物合成和干旱胁迫的正向调控作用。Chen等^[17]发现拟南芥WAX2突变体植株表皮膜的厚度和结构得到显著改变,对干旱更加敏感,表明WAX2基因表达水平的增加可以提高植物抗旱能力。Seo等^[18]研究发现MYB96-1D突变体植株中许多参与表皮蜡生物合成的基因上调表达,导致表皮蜡的积累大大增加,转录因子MYB96通过与编码脂肪酸延伸酶基因的启动子结合来调节角质层蜡质的生物合成。

目前,关于谷子抗旱过程中角质发挥的作用研究较少,跟谷子角质相关的转录因子也鲜有报道。

本研究通过对干旱胁迫后的赤谷16及其亲本进行转录组测序,探究角质在谷子响应干旱胁迫时的作用机制,挖掘跟谷子角质合成相关的抗旱候选基因。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2018年10月在山西农业大学作物遗传育种省重点学科实验室人工气候培养箱进行,所用材料为耐旱品种赤谷16（M79）及其母本赤谷10号（E1）和父本承谷8号（H1）,其中赤谷16是生产上广泛推广应用的抗旱品种。

谷子种子用0.5% NaClO进行表面灭菌,再用ddH₂O冲洗3次之后播种在花盆（直径8cm,高10cm）内,花盆的基质土是草炭土和营养土（1:1）,每盆播种15粒,将花盆放入人工培养箱（光照16h/黑暗8h,对应的温度为30℃/22℃）中培养,7d之后进行间苗,每盆留下长势一致的5株幼苗。3周之后,各选3份材料中长势均匀的幼苗50株,分为对照组（M79-CK,E1-CK和H1-CK）和处理组（M79-DR、E1-DR和H1-DR）,对照组每天浇水,处理组不浇水并且利用土壤水分测定仪TDR300（Spectrum,美国）测定土壤水分含量。在干旱第6天（土壤含水量约为20%）取谷子顶部第2片叶子,用液氮冷冻并保存于-80℃的冰箱中。

1.2 RNA提取、cDNA文库构建和转录组测序

从18个样本中提取RNA（3个基因型×2次处理×3次重复）,使用TrizolRretagent（Invitrogen,Waltham,MA,美国）进行后续RNA序列分析。用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA,然后在高温下破碎,再以破碎后的mRNA为模板,用六碱基随机引物（random hexamers）合成cDNA第一链,再合成第二条链,纯化双链cDNA并进行末端修复,加A尾连接到测序接头上,使用VAHTSTM DNA清洁珠进行分类,得到300~400bp的片段,然后进行PCR扩增,生成cDNA文库。最后,南京诺唯赞生物技术有限公司使用PE150模式在HiSeq X Ten（Illumina,San Diego,CA,美国）平台上汇集并测序了这些文库^[19]。

1.3 基因的生物信息学分析

利用豫谷1号基因组数据库Phytozome12（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Sitalica）进行关键词搜索,输入基因名称,查找8个角质合成基因的基因参考序列信息^[20];使用BLAST进行搜索比对,查找基因信息描述;用ExPASY（https://web.expasy.org/compute_pi/）分析谷子角质合成基因的等电点;用GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析基因内含子外显子结构;用ExpasyProtscale（https://web.expasy.org/protscale/）分析谷子角质合成基因编码蛋白质的亲水性和疏水性;利用MAGA 7.0软件对谷子8个角质合成基因与玉米、水稻和拟南芥的基因进行比对,用邻近法构建系统进化树,设置Bootstrap值为1 000;通过TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白质跨膜结构;利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html）预测蛋白的二级结构;使用2^-△△CT的方法计算基因相对表达量,表达量的值经过公式log₂（FPKM+1）进行转换,使用R/Bioconductorgplots包的heatmap.2函数绘制聚类热图。

2 结果与分析

2.1 谷子角质合成基因的基因结构与理化性质

对M79及其父母本干旱胁迫后,转录组测序结果显示,有8个角质合成基因差异表达,分析它们的基因结构和理化性质,包括基因组序列的长度、CDS长度、基因在染色体上的位置、基因所编码氨基酸数量、基因的等电点和分子量。由表1可见,谷子的8个角质合成基因分别位于1、2、6、7、8号染色体的不同位点。它们的基因序列长度有很大区别,最小的为1 629bp（Seita.7G197000）,最大的为6 547bp（Seita.1G237600）;蛋白长度最小是454个氨基酸（Seita.8G128800）,最大为626个氨基酸（Seita.1G362700）,其余6个蛋白氨基酸数目在497~620,相对应的蛋白分子量范围为134 851.34（Seita.7G197000）~545 565.01（Seita.1G237600）Da,CDS长度为1 365（Seita.8G128800）~1 881bp（Seita.1G362700）。等电点分析发现,这些基因的等电点都在4.64（Seita.8G128800）~4.86（Seita.7G197000）,均显酸性。

2.2 谷子角质合成基因内含子和外显子结构组成分析

利用GSDS 2.0对谷子角质合成基因的CDS、基因序列进行结构分析。由图1可见,除Seita.7G197000没有内含子之外,其余基因都有内含子结构。Seita.1G219200和Seita.8G128800含有1个内含子,Seita.1G362700和Seita.6G138200含有5个内含子,Seita.6G244000含有6个内含子,Seita.1G237600和Seita.2G306800含有9个内含子。Seita.7G197000不含有上下游序列,Seita.8G128800有较长的上下游序列。

图1

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图1 谷子角质合成基因结构

Fig.1 Structure of cutin synthetic genes in foxtail millet

2.3 角质合成基因编码蛋白的亲水和疏水性分析

使用ExpasyProtscale分析了谷子角质合成基因所编码蛋白的亲水和疏水性,结果如图2所示,8个角质合成基因所编码蛋白的氨基酸残基中疏水性最强的为Seita.1G362700（2.9900）,最弱的为Seita.2G306800（1.8500）;亲水性最强的为Seita.1G362700（-3.4800）,最弱的为Seita.7G197000（-2.2100）。在8个角质合成基因编码的蛋白中,亲水性氨基酸数量明显较多。

图2

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图2 谷子角质合成基因所编码蛋白的亲水性和疏水性分析

Fig.2 Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of proteins encoded by cutin synthetic genes in forctail millet

表1 谷子角质合成基因的基本信息

Table 1 Basic information of cutin synthetic genes in foxtail millet

基因名称 Gene name	基因长度(bp) Length of gene	CDS长度(bp) Length of CDS	染色体 Chromosome	氨基酸数目 Number of amino acids	等电点 PI	分子量(Da) Molecular weight
Seita.1G219200	2 276	1 590	1	529	4.83	187 041.49
Seita.8G128800	5 998	1 365	8	454	4.64	499 484.30
Seita.7G197000	1 629	1 629	7	542	4.86	134 851.34
Seita.1G237600	6 547	1 863	1	620	4.67	545 565.01
Seita.2G306800	3 599	1 509	2	502	4.83	299 516.29
Seita.6G138200	4 194	1 755	6	584	4.76	348 222.58
Seita.1G362700	3 031	1 881	1	626	4.75	253 210.31
Seita.6G244000	4 219	1 494	6	497	4.76	351 628.77

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2.4 干旱胁迫下谷子角质合成基因的表达量分析

对干旱胁迫后的M79及其母本E1和父本H1进行转录组测序,绘制了3个品种在干旱和对照条件下的基因表达热图（图3）,发现经干旱胁迫处理后,8个与角质合成相关的差异表达基因在3个谷子品种M79、E1和H1中与对照相比都有不同程度的变化,有部分基因表达变化较明显,其中,基因Seita.8G128800和Seita.7G197000在M79中有明显的上调表达,其余6个基因均在M79中下调表达;基因Seita.1G219200、Seita.6G138200、Seita.1G362700在E1和M1中都表现出上调表达,而Seita.2G306800在父母本中下调表达。

图3

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图3 干旱处理后M79、H1和E1角质合成基因差异表达聚类热图

Fig.3 Cluster heatmap of differential expressions of cutin synthetic genes in M79, H1 and E1 after drought treatment

2.5 谷子角质合成基因系统进化树分析

使用MAGA 7.0软件对谷子中8个角质合成基因与水稻、玉米、拟南芥的基因进行多序列比对,构建系统进化树,分析基因进化过程,比较亲缘关系。如图4,Seita.8G128800、Seita.1G219200、Seita.1G362700、Seita.6G138200、Seita.6G244000与玉米中的一些基因亲缘关系较近,Seita.7G197000、Seita.2G306800和Seita.1G237600与水稻中的一些基因亲缘关系较近,而这些基因与拟南芥的亲缘关系较远。

图4

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图4 谷子角质合成基因进化树

Fig.4 The evolution tree of cutin synthetic genes in foxtail millet

2.6 谷子角质基因跨膜结构域预测

利用TMHMM Server v. 2.0预测8个角质合成基因的跨膜结构域,发现Seita.7G197000、Seita.1G237600、Seita.6G244000和Seita.1G362700均有较为明显的跨膜结构域,Seita.1 G237600的跨膜结构域最多,如图5所示,在0到400个氨基酸位置有4个跨膜结构域。其余基因则没有明显的跨膜结构域,如Seita.8G128800,仅在150~200和300~350个氨基酸的位置有少量碱基锚定在内膜上。表明谷子角质合成基因所编码的蛋白中仅有部分为跨膜蛋白。

图5

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图5 谷子角质合成基因的跨膜结构域预测

Fig.5 Transmembrane domain prediction of cutin synthetic genes in foxtail millet

2.7 谷子角质基因蛋白二级结构预测

表2中利用软件SOPMA预测8个谷子角质合成基因的蛋白二级结构,发现这些蛋白主要由α螺旋、β转角、无规则卷曲和延伸链组成。除基因Seita.6G138200外,其余基因的蛋白结构中α螺旋所占比例最大,均在40%以上;β转角所占的比例最小,在13%以下。无规则卷曲所占的比例变化较大,在基因Seita.1G219200中占13.80%,在Seita.6G138200中所占比例达到35.45%。因此,这8个角质合成基因的蛋白结构存在差异,而这些差异可能导致基因在角质合成中行使不同的功能。

表2 谷子角质合成基因蛋白二级结构预测

Table 2 Prediction of secondary structure of foxtail millet cutin synthetic gene protein %

蛋白名称 Protein name	α螺旋 Alpha helix	β转角 Beta turn	无规则卷曲 Random coil	延伸链 Extended strand
Seita.1G219200	51.04	9.26	13.80	25.90
Seita.8G128800	40.62	9.27	31.35	18.76
Seita.7G197000	45.57	11.99	26.01	16.42
Seita.2G306800	50.60	7.97	24.90	16.53
Seita.6G138200	27.05	12.16	35.45	25.34
Seita.1G362700	45.05	7.19	29.39	18.37
Seita.6G244000	43.86	7.65	28.37	20.12
Seita.1G237600	42.26	8.71	28.23	20.81

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3 讨论

植物的干旱调节机制是一个复杂的过程,植物可以通过控制气孔开闭减少蒸腾作用,或者通过细胞和组织从四周土壤中汲取更多的水分等方式,使自身在受到干旱胁迫时可以维持正常的生长发育^[21,22]。角质调节是重要的抗旱生理过程,研究干旱胁迫下角质合成基因的表达与调控,可以揭示谷子抗旱分子机理,筛选出抗旱候选基因,为谷子抗旱分子育种提供理论依据。

在本研究中,干旱处理后对M79及其双亲中角质合成基因进行聚类热图分析,结果显示,8个角质合成基因在M79中的表达都发生明显变化,因此,推测角质合成基因在谷子抗旱过程中发挥作用。其中,Seita.8G128800和Seita.7G197000在M79中均上调表达,而其余的基因表现为下调表达,说明这些基因通过正向调控某些路径或者抑制一些植物体内的生理生化过程,参与到角质的合成中,使谷子表现出更高的抗旱性。SHN/WIN1基因是最早报道的参与表皮蜡质调控的转录因子,可以通过调控CER1、KC1和CER2的表达,增加蜡质的生物合成^[23]。而在拟南芥中MYB 106-VP16可以诱导WIN1/SHN1表达,MYB 106-SRDX抑制WIN1/SHN1表达^[24]。这些研究结果表明角质的生物合成是多基因协同调节的。在谷子中,8个角质合成基因共同发挥作用,通过上调表达或下调表达,参与角质的调控,当植株受到干旱胁迫时,可以更好保持植株体内的水分。

从8个角质合成基因编码蛋白的亲、疏水性分析结果可以看出,这些蛋白均为亲水性蛋白,而亲水性蛋白可以在植物遭受干旱胁迫时替代水分子发挥作用,维持膜结构的形态,减轻干旱对植物造成的损伤,提高植株的抗旱性^[25]。通过进化树分析显示,谷子角质合成基因与玉米和水稻的基因有较近的亲缘关系。在玉米中也已经发现了一些基因参与角质合成的调控,GL1是参与玉米幼苗叶片角质合成途径的重要基因,玉米Glossy1（GL1）突变体表现为角质层蜡质沉积减少,角质层膜结构和毛状体发育改变^[26]。Glossy 8突变体则使Glossy 8可以在玉米角质的长链脂肪酸合成过程中起到β-酮酰基还原酶（KCR）的作用,催化β-酮酰基辅酶A的还原,参与角质的生物合成^[27,28]。谷子和玉米都属于禾本科C₄作物,在生物进化的过程中有相似的进化途径,因此,这些物种中可能存在同源基因在角质合成调控中发挥相似的作用,值得进一步探讨和研究。拟南芥的基因与谷子角质合成基因亲缘关系较远,可能在干旱胁迫时,双子叶植物与单子叶植物的角质调控方式不同。

本研究中虽然证实8个角质合成基因在谷子抗旱中发挥作用,但是具体参与的调控路径并不清楚,因此这些基因的功能还需要进一步验证。角质合成的调节过程是复杂的,需要多种代谢途径及信号转导途径的共同参与。因此,研究某几个或者某一类基因并不能清楚了解角质参与的抗旱机制,挖掘更多的基因并探究基因间的相互关系可以为作物基因改良提供理论基础。

4 结论

在谷子抗旱性强的品种M79中发现了8个角质合成相关基因,生物信息学分析发现,这8个基因均编码亲水性蛋白,且与玉米和水稻基因的亲缘关系密切,部分蛋白有跨膜结构域,蛋白二级结构中α螺旋所占比例较多。其中基因Seita.8G128800和Seita.7G197000在干旱胁迫后明显上调表达,正向调控了谷子的抗旱过程。

参考文献

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文中引用次数倒序

被引期刊影响因子

[1]

陈雪娇, 张旭东, 韩治中 , 等.

半干旱区沟垄集雨种植谷子的肥料效应及其增产贡献

作物学报, 2018,44(7):1055-1066.