紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导及胚状体分化研究

图1 固原紫花的不同外植体及对应的出愈状态

(a)、(b)、(c)为外植体，(d)为出愈状态

Fig.1 Different explants ofGuyuan alfalfa and corresponding callus status

2.3 2,4-D与不同细胞分裂素组合对苜蓿胚性愈伤组织诱导及分化的影响

常见的苜蓿胚性愈伤组织诱导是通过生长素2,4-D与低浓度细胞分裂素6-BA、KT的组合。通过2.2结果可见，2,4-D浓度在6mg/L及以上时对苜蓿愈伤组织的诱导具有抑制作用。采用表1配方，经过20~25d的诱导，除了CK，其余10个组合外植体都已完全脱分化，诱导率达到100%（表3）。当2,4-D浓度为5mg/L时，诱导出的愈伤块体积略大于其他浓度，但愈伤块在颜色和质地上无区别，说明1~5mg/L2,4-D组合0.5mg/L的6-BA与KT对愈伤组织的形成有促进作用。添加6-BA和KT后形成的愈伤组织在质地上有区别，前者为黄绿色，后者整体偏白色（图2）。

表3 不同诱导培养基的愈伤块的分化

Table 3 Diff erentiation of callus in different induction media

指标Index	I1	I2	I3	I4	I5	I6	I7	I8	I9	I10
接种数Number of explants	120	120	120	120	120	120	120	120	120	120
诱导率Rate of callus induction (%)	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
分化率Rate of callus embryogenesis (%)	7.2b	10.2a	8.4b	6.3b	9.8ab	8.6b	12.6a	8.6b	7.4b	9.8ab

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图2

图2 不同细胞分裂素（6-BA、KT）与2,4-D组合形成的愈伤组织

Fig.2 Callus formed by combinations of differentcytokinins (6-BA, KT) with2,4-D

分别将以上完全脱分化的愈伤块转入不添加任何激素且培养条件一致的分化培养基1/2MS中（参照李娟等^[9]的文章），观察分化出的胚状体，统计分化率（表3）。

经过20~30d的培养，主要形成2种类型的愈伤组织，一种是有绿色球形胚或有绿色芽点的愈伤组织，多次继代，不失活，属于胚性愈伤组织；另一种是无组织状态、继代1次后逐渐褐化、失活，为非胚性愈伤组织（图3）。I1~I10培养基诱导出的愈伤组织在1/2MS培养基内都分化出了胚状体，但分化率都不高。添加6-BA的组合（I1~I5）中，I2组合的分化率最高（10.2%），I1组合最低（7.2%）。添加KT的组合（I6~I10）中，I7组合的分化率最高（12.6%），I9组合最低（7.4%）。由此可见，分化率最高的培养基2,4-D添加浓度为2.0mg/L。不同浓度2,4-D与6-BA组合的胚状体平均分化率为8.4%，与KT组合的胚状体平均分化率为9.4%，诱导培养基I7分化率最高，2,4-D添加浓度为2.0mg/L、KT为0.5mg/L。

图3

图3 2种不同类型愈伤组织

Fig.3 Two different types of calluses

2.4 不同分化培养基对胚性愈伤组织/体胚苗的影响

将添加2.0mg/L2,4-D组合0.5mg/LKT的培养基诱导出的完全脱分化愈伤块转入分化培养基，如图4所示，5个分化培养基胚状体分化率均高于CK，其中D4的分化率（42.7%）显著高于其他处理（P<0.05），D5的分化率最低，略高于CK（P>0.05）。

图4

图4 不同分化培养基内胚状体/体胚苗的分化率比较

不同小写字母表示0.05水平差异显著

Fig.4Comp arison of differentiation rates of embryo/seedlings in different differentiation media

The different lowercase indicate significant difference at 0.05 level

2.5 再生苗的诱导分化培养

将以上分化出的再生苗经生根、壮苗培养（1/2MS培养基+0.1mg/LIBA）后扩繁，扩大再生苗数量。以再生苗的幼嫩叶片和叶柄为外植体，以不同浓度的2,4-D（1.0~8.0mg/L）组合0.5mg/L6-BA、KT培养基诱导，20d后发现外植体均能100%诱导出胚性愈伤组织（黄绿色，有绿点），在不添加激素的分化培养基（1/2MS）也分化出大量的胚状体，且能分化为无根小苗，剥离出后在壮苗培养基里可发育成完整植株。

3 讨论

3.1 不同来源外植体对苜蓿愈伤组织诱导及胚状体分化的影响

紫花苜蓿体胚诱导途径中常见的外植体有下胚轴、子叶、茎段、叶柄和根等，通常选择生理代谢旺盛、分化程度较低的离体组织。下胚轴分化能力相对较强，是最佳外植体^[11-12]。以子叶为外植体，可成功建立苜蓿高频再生体系^[13-14]。本研究发现，下胚轴和茎段出愈早于叶片，完全脱分化时间短于叶片2~4d，但经24d诱导后，都能100%脱分化。不同外植体脱分化后的愈伤组织形态和质地没有明显区别。但有研究^{[10⇓⇓⇓⇓-15]}显示，体胚分化能力与外植体来源有关。本研究中，3种外植体的愈伤组织转入不添加任何激素的分化培养基后，分化率都较低，最终分化出胚状体的愈伤组织很少，多数都失活并褐化死亡，无法比较不同外植体的体胚分化能力。

3.2 2,4-D与不同细胞分裂素组合对苜蓿愈伤组织诱导及体细胞胚发育的影响

2,4-D浓度是影响苜蓿愈伤组织诱导率的主要因素^[16]。不添加2,4-D（CK）的培养基苜蓿诱导率为0.0%，而添加2,4-D的培养基都有愈伤组织出现。当2,4-D浓度为2、4mg/L时，诱导率达100.0%；当浓度为8mg/L时，诱导率最低，愈伤块体积最小，开始褐化时间也早，说明高浓度的2,4-D对苜蓿愈伤组织的诱导有抑制作用，这个结论与史毅等^[10]研究结果一致。

2,4-D在苜蓿愈伤组织的诱导和体细胞胚早期发育过程中起关键作用，且常与低浓度细胞分裂素配合使用^[11]。王英哲等^[13]研究显示，2,4-D与KT组合能分化出胚状体。张凌云等^[7]认为，2,4-D与6-BA组合是最佳诱导培养基。李玉珠等^[4]研究显示，在相同浓度2,4-D培养基上，有的品种添加KT能诱导出胚状体，而有的品种添加6-BA有胚状体出现。本研究中，当2,4-D浓度为1.0~5.0mg/L时，与0.5mg/L 6-BA或KT组合，都有胚状体产生，但胚状体分化率都较低，故有必要开展分化培养条件研究。

3.3 不同分化培养基对胚状体分化的影响

高浓度的2,4-D对苜蓿胚发生存在抑制作用^[17]，故通常在愈伤组织脱分化后降低2,4-D浓度或不添加。本研究发现，5个添加激素处理（3个添加KT组合NAA，1个只添加KT，1个添加6-BA组合NAA）分化率都高于不添加激素的1/2MS培养基对照，说明添加低浓度的KT、6-BA与NAA组合以及单独添加低浓度KT对苜蓿体胚分化都有促进作用。细胞分裂素对促进体细胞胚成熟及进一步分化有显著作用^[18]。KT有促进组织细胞分裂和分化不定芽的作用^[8]，但KT的添加不利于愈伤组织分化^[19]。以上研究结果的不同可能与诱导愈伤组织的基本培养基、培养条件、苜蓿品种等因素有关。苜蓿体胚分化依然存在再生率不稳定和试验重复性差等问题，应根据不同苜蓿品种开展相应的分化培养条件、激素种类和浓度等研究。

3.4 再生苗对高频再生体系建立的影响

以再生苗为外植体，开展愈伤组织的诱导和分化，发现叶片和叶柄在不同浓度2,4-D（1.0~8.0mg/L）和低浓度6-BA、KT组合下，在不添加激素的1/2MS培养基上均能100%产生体细胞胚，经剥离后都能发育成完整植株。从愈伤组织的诱导到完整植株的出现，与初代相比，再生周期缩短，植株更健壮，说明基因型是影响苜蓿体胚再生植株形成的最关键因素。这也验证了Sairam等^[20]关于苜蓿愈伤组织的再生能力受基因型控制且高度遗传的结论。由此可见，建立一个苜蓿品种稳定高频的体细胞胚胎再生途径，可先诱导、分化出少数再生植株，再进行大量扩繁，从而以再生植株的外植体建立再生体系。

4 结论

以苜蓿地方品种固原紫花为材料，通过2,4-D与不同细胞分裂素组合及胚状体分化培养基的比较筛选，得出胚性愈伤组织诱导率最高的培养基为MS基本培养基+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT，诱导率为12.6%；分化率最高的培养基为1/2MS+0.4mg/LKT，分化率为42.7%。以分化出的再生苗开展诱导、分化，很容易建立稳定的体胚高频再生体系，可见苜蓿再生能力高度遗传，高度依赖基因型。

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通过外植体类型、生长素和细胞分裂素浓度等因素对紫花苜蓿愈伤组织诱导、分化影响的试验，建立了高效的紫花苜蓿组织培养体系，即以真叶为外植体，在MS+0.2mg/L 2,4-D+0.01mg/L NAA+0.2mg/L KT培养基上进行愈伤组织的诱导，诱导率可达到100%，愈伤组织继代2~3次，然后在MS培养基上分化，分化率可达90%。分化苗转入1/2MS培养基进行生根，形成完整的组培苗。愈伤组织诱导的正交试验表明，2，4-D浓度是影响苜蓿愈伤组织诱导率的主要因素，其次是外植体类型、NAA浓度、6-BA浓度和KT浓度;对苜蓿愈伤褐化率影响较大的因素是外植体类型，其次是KT、2，4-D、6-BA、NAA浓度。外植体类型对愈伤组织诱导率和褐化率的影响均达到极显著水平（P<0.01）;生长素（2,4-D、NAA）对苜蓿愈伤组织的诱导作用大于细胞分裂素（6-BA、 KT）。分化试验表明，紫花苜蓿愈伤组织分化的主要决定因素是愈伤诱导培养基的激素配比。

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