玉米是我国第一大粮食作物，主要用作初级食品、养殖饲料和深加工原料。受全球气候变暖的影响，我国干旱、半干旱化的耕地面积持续增加，全国大部分地区干旱水平呈上升趋势^[1]。我国每年因旱灾导致的玉米减产高达15%~20%，干旱已经成为影响我国玉米稳产、增产的主要制约因素之一^[2]。

土壤微生物是土壤生态系统中最活跃的组分，其参与土壤有机质的形成与转化、化学元素循环以及植物营养和初级生产等，在维持土壤―植被生态系统的稳定、健康和演替等方面具有重要作用^[3-4]。作为一种环境胁迫因子，干旱胁迫通过塑造植物根周及根系土壤微生物群落结构，富集特定微生物种群，进而影响植物生长和土壤―植被生态系统功能^[5]。土壤微生物群落对胁迫信号的适应性响应可用“cry-for-help”模型解释，即受胁迫的植物改变其根系分泌物的化学组分，进而影响根际土壤微生物群落结构，改变的微生物群落通过直接抑制病原菌和间接激活宿主系统抗性共同为植物提供保护^[6]。研究^[7]表明，干旱胁迫下菌根真菌（AMF）接种可提高大豆和玉米等作物植株生物量、叶片相对含水量、光合速率和蒸腾速率，降低气孔阻力，使宿主植物更有效地利用水分，从而增强抗旱能力。

磷是作物生长的重要养分之一，其对作物的生长发育和光合作用等生理过程作用显著，作物从土壤吸收的水溶性磷显著影响作物产量及品质。此外，土壤磷的适当增加可促进作物根系生长，提高干旱等逆境下植物对氧化胁迫和渗透胁迫的耐受性^[8-9]。土壤中磷大多数为难溶性磷，解磷菌能将植物难以吸收利用的土壤难溶性磷转化为可直接利用的水溶性磷^[10]。同时，土壤水溶性磷的增加会影响干旱胁迫下土壤微生物丰度及群落结构，进而调节植物对干旱胁迫的耐受性^[11]。

本研究以实验室自制的解磷菌和丛枝真菌菌根复合微生物菌肥（AP）为材料，通过转录组测序分析了干旱胁迫下玉米幼苗叶片转录组水平差异，初步分析添加AP下玉米响应干旱胁迫的相关通路，为后续分析玉米耐旱分子机制提供基础。

供试玉米材料为“鄂玉16”，由湖北省十堰市农业科学院选育。挑选大小一致、籽粒饱满的种子，用10% H₂O₂浸泡消毒10 min，蒸馏水冲洗后置于铺有湿润滤纸的培养皿中，25 ℃催芽2 d后播种。

解磷菌肥由本实验室从三峡水库消落带黄花草木樨[Melilotus officinalis (L.) Pall.]等优势适宜植物根际土筛选扩繁而得，其溶磷能力为104.602 mg/L，有效活菌数约为2.56×10⁸个/g；AMF菌肥中根内根孢囊霉（Rhizophagus intraradices，RI）、摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae，FM）、细凹无梗囊霉（Alariodeglous etunicatum，AS）由长江大学根系生物学研究所提供；以白三叶草（Trifolium repens L.）为载体进行扩繁，获得含有孢子、菌丝和侵染根部的混合物，用混合物接种（每克约50个孢子）。AP复合菌肥由解磷菌肥和AMF菌肥混合而成。

供试土壤采集于重庆三峡学院山顶坡地，基本理化性质为pH 6.5、有机质4.51 g/kg、碱解氮29.4 mg/kg、有效磷3.9 mg/kg、速效钾25.1 mg/kg。土壤肥力等级处于5~6级。

丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒均购自南京建成生物研究所。RN40-EASYspin植物microRNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司。Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Mix逆转录试剂盒和2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）试剂盒购自北京擎科生物科技有限公司。无菌去离子水为实验室自制，其他试剂均为国产分析纯。

2022年4-5月在重庆三峡学院校内园艺大棚开展盆栽试验。将5 kg灭菌土装盆，盆土靠盆外沿一圈间隔设5个播种穴。设置CK、A、P和AP共4个处理，具体操作为播种穴底部分别添加对照菌肥（CK：灭活的1.0 g解磷菌肥+灭活的1.5 g AMF菌肥）、解磷菌肥（A：1.0 g解磷菌肥+灭活的1.5 g AMF菌肥）、AMF菌肥（P：灭活的1.0 g解磷菌肥+1.5 g AMF菌肥）、复合菌肥（AP：1.0 g解磷菌肥+1.5 g AMF菌肥）。菌肥上覆薄土，喷水湿润，2 d后播种。2022年4月1日播种，每穴1粒，每盆播种5粒，并施30 g尿素和200 mL水，待玉米苗长至3片叶时疏苗，每组土盆留高低一致、长势良好的玉米苗，3个生物学重复。疏苗前用50% Hoagland营养液灌盆，疏苗后每3 d用100% Hoagland营养液灌根保持正常水分和养分。盆土保持正常水分至2022年5月8日，第1次取样（干旱胁迫第0天）后开始干旱胁迫并依次在干旱胁迫5、10和15 d取样。干旱胁迫期间每天监测土壤水分，维持20%~25%的土壤含水量。每次取样均取玉米苗的第3片叶，测定叶片生理生化指标，并根据检测结果，送干旱胁迫第10天的CK和AP处理作转录组测序。

生理生化指标检测共取样2.0 g，同时转录组和qPCR检测各取样0.5 g。取样后，用蒸馏水冲洗并快速转入预冷的5 mL冻存管，现场液氮速冻，置于干冰盒迅速带回实验室制样，检测生理生化指标及提取RNA。

参照Phillips等^[12]方法测定AMF菌根侵染率，将玉米根段切成1.0 cm的小段，用酸性品红进行染色，以侵染根段占总根段的百分比表示菌根侵染率。测定AMF侵染率在50%~60%。

采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，分别采用氮蓝四唑法、愈创木酚显色法和紫外分光光度法测定SOD、POD和CAT活性，按照试剂盒说明书进行。

按照RN40-EASYspin试剂盒方法提取microRNA组分和总RNA。用ThermoFisher分光光度计检测核酸浓度，确认RNA样品的OD₂₆₀/OD₂₈₀均在1.8~2.2。电泳检测显示RNA样品特征性条带完整清晰，无明显弥散或拖尾。送样至北京百迈克生物科技有限公司建库并基于Illumina NovaSeq 6000平台测序。

测序原始数据经评估及质控分析，去除低质量数据和污染数据，过滤rRNA数据后比对到参考基因组得最终注释后的转录组数据。利用DEseq 2软件包筛选差异表达基因（differentially expressed gene，DEG），筛选的标准为|log₂FC|≥1.5且P<0.01。采用ClusterProfiler软件包作GO功能富集，采用KOBAS软件包作KEGG Pathway通路富集。

挑选6个差异表达基因，通过PrimerQuest Tool在线程序设计扩增引物（表1）。以玉米GAPDH基因作内参，按照Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Mix试剂盒说明作逆转录扩增，以2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）作实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）扩增。qPCR扩增平台为QuantStudioTM 1 Plus（ABI，美国），扩增反应程序为95 ℃ 2 min预变性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40次循环。

采用Excel 2019整理数据；采用SPSS 25.0进行单因素分析和Turkey多重比较；采用Origin pro 21.0进行基因表达水平、相关性分析和作图。

4个处理玉米叶片中MDA含量在干旱胁迫开始前（第0天）无显著性差异，随着胁迫时间的延长，CK处理玉米叶片中MDA含量显著增加（P<0.05），其余3个处理玉米叶片中MDA水平也呈增加趋势，但增加幅度显著低于CK（P<0.05）（图1）。至胁迫15 d，CK、P、A和AP处理玉米叶片中MDA水平分别比胁迫开始前增加1.83、1.28、1.21和0.77倍。除胁迫开始前外，胁迫5、10和15 d，AP处理玉米叶片中MDA含量均明显低于CK处理。随着胁迫时间延长，4个处理玉米叶片中SOD和POD活性均呈先上升后降低或保持不变的趋势。从胁迫开始前到胁迫第10天，4个处理玉米叶片中SOD和POD活性达最高水平；从胁迫10 d至15 d，P、A和AP处理玉米叶片中SOD活性显著降低（P<0.05），POD活性无明显变化。此外，胁迫第5、10和15天，AP处理玉米叶片中的SOD活性均显著高于CK处理（P<0.05）。整个干旱胁迫处理期间，AP处理玉米叶片中POD活性均显著高于CK处理（P<0.05）。在整个胁迫处理期间，玉米叶片中的CAT活性最低和最高处理均分别为CK处理和AP处理。整体来看，在整个胁迫期间，与CK处理相比，P、A和AP处理玉米叶片中的MDA维持在相对较低水平，而抗氧化相关酶活性维持在较高水平。

转录组原始测序数据（raw data）经数据清洗得到干净数据（clean data），并进一步对后者作质量评估。如表2所示，AP和CK处理共6个样本的干净数据中不确定碱基占比（N%）均为0，GC含量为43.61%~44.89%，Q20为97.94%~98.10%，Q30为93.75%~94.15%。表明整体测序质量较好，可满足后续生物信息学分析。

以每千个碱基的转录每百万映射读取的片段（fragments per kilobase of transcript per Million fragments mapped，FPKM）衡量基因表达水平^[13]。由图2可知，与处理间样本相比（AP1 vs CK1），基因表达水平在处理内样本间（AP2 vs AP3）皮尔逊相关系数相对较高（r=0.969）。其他处理内样本间相关分析结果类似，说明CK和AP处理内的样本重复性较好，后续分析可信度高。

干旱胁迫处理下，以CK处理为对照，AP处理玉米叶片中的差异表达基因（differential- expressed genes，DEGs）总数为320个，其中204个上调表达，116个下调表达（表3）。进一步对筛选的DEGs作数据库注释，注释到蛋白质直系同源簇数据库（clusters of orthologous groups of proteins，COG）、基因本体数据库（gene ontology，GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、真核生物直系同源数据库（clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes，KOG）、非冗余蛋白质序列数据库（non-redundant protein sequence database，NR）、蛋白质家族数据库（protein families database，Pfam）、瑞士蛋白质数据库（Swiss protein sequence database，Swiss-Prot）和直源同系蛋白分组比对数据库（evolutionary genealogy of genes：non-supervised orthologous groups，eggNOG）的DEG数目分别为100、244、197、140、303、253、224和255个，共注释到303个DEG。

GO富集分析是将基因按照其功能进行归类，有助于了解基因产物的属性及生物学功能。筛选的DEG富集到生物过程、细胞组分和分子功能3个主类的占比分别为34.33%、43.12%和22.55%（图3）。富集DEG数目由多到少的前10个子类依次分别是催化活性、结合、细胞、细胞组分、代谢过程、细胞过程、膜、膜组分、单有机体过程和细胞器，其中富集DEG数目前2位的大类均为分子功能，前10位富集占比最高的为细胞组分。

197个DEG注释到KEGG数据库中103个分类代谢途径中，取显著性Q值最小的前20个通路作KEGG富集分析。结果（图4）显示，按照富集显著性大小依次为植物―病原互作、淀粉和蔗糖代谢、其他类型O-聚糖生物合成、玉米素生物合成、半乳糖代谢和氨基酸生物合成等6个代谢通路，显著富集通路中共有41个DEG，其中上调表达25个，下调表达16个。

以maize-GAPDH为参照基因，用qRT-PCR扩增随机挑选的DEGs，相对定量采用2^-∆∆Ct法，其中∆∆Ct=（待测样品的目的基因Ct值-待测样本的参照基因Ct值）-（对照样品的目的基因Ct值-对照样本的参照基因Ct值），以log₂（Fold Change）表示转录组和qRT-PCR检测的DEGs表达变化倍数。如图5所示，6个DEG的表达趋势一致，2种检测方法的皮尔逊相关系数为0.853，P<0.05，表明转录组分析结果可信。

近年来，受全球气候变暖的影响，作物受旱灾的发生率逐年加剧，对全球粮食安全带来巨大挑战。作物遭受干旱胁迫时，通常会出现生活周期缩短和组织器官发生形态改变等现象，严重影响其产量。干旱胁迫信号主要诱发渗透胁迫及氧化胁迫，进而破坏细胞膜结构引起细胞内蛋白质和核酸等组分的代谢紊乱^[14]。目前，应对农业干旱的措施主要包括耐旱品种选育、节水农业技术推广和植物生长调节剂施用等^[15-16]。

植物体内普遍存在着清除细胞活性氧自由基（包括SOD、POD、CAT等酶抗氧化系统和V_C、V_E、谷胱甘肽和类胡萝卜素等非酶抗氧化系统）和维持细胞水分稳定的渗透压调节机制，共同提高植物的逆境耐受性^[17]。干旱胁迫下，过度的活性氧自由基积累打破了植物细胞原有的活性氧自由基清除系统的动态平衡，使得细胞膜过氧化，质膜透性增加进而引起代谢紊乱甚至细胞死亡^[18]。研究^[19]表明，植物受干旱胁迫强度与膜质受损程度的指标MDA水平有很强的相关性，在一定强度的胁迫内，作物的抗氧化酶活性与MDA含量呈正相关。本研究（图1）显示，随着干旱胁迫时间的持续，4个处理下植物叶片的MDA浓度都在不断增长，而CK处理MDA含量增长趋势明显高于AP处理，表明添加AP可明显降低玉米叶片细胞膜脂过氧化的水平，进而降低干旱胁迫对细胞膜伤害。4个处理玉米叶片中的SOD与POD活性随干旱胁迫时间增加均呈先上升后下降的趋势，说明在一定程度内的干旱胁迫与植物叶片SOD和POD活性呈正相关，这与张仁和等^[20]研究报道一致。对比干旱胁迫期间4个处理玉米叶片的MDA水平和酶活性变化趋势，可知AP处理的玉米苗对干旱胁迫的耐受性强于其他3个处理。

植物―微生物互作一方面改变植物根系分泌物驱动根系及根周土壤微生物种群结构及功能变化，另一方面改变的微生物种群通过影响多个信号通路基因表达等方式提高植物对生存环境的耐受性，这种双向调节机制在干旱、盐碱和病虫害发生等逆境胁迫中普遍存在^[21⇓-23]。本研究GO富集结果显示，生物过程类别中单有机体过程、细胞过程和代谢过程，分子功能类别中的结合与催化活性，细胞组分类别中的细胞组分、膜组分和细胞器组分等均显示较多DEG，表明为维持玉米苗生长，上述多个途径可能共同参与了玉米响应干旱胁迫的适生性调节，与多个研究^[24]结果类似。本研究中，KEEG显著富集到6个代谢通路，这些通路中有25个DEG上调表达，有16个DEG下调表达，合计41个DEG。其中植物―病原互作通路富集结果显示，干旱胁迫下细胞壁壁厚的增加可能受到活性氧和NO水平变化的诱发，前者通过氧化交联加固细胞壁，后者导致气孔闭合以加厚细胞壁，进而增加细胞结构的稳定性^[25]。植物受到干旱等逆境胁迫时，通过增加细胞内氨基酸和碳水化合物水平等来维持细胞渗透平衡^[26]。研究^[27]表明，植物受干旱和盐碱等胁迫程度与细胞内脯氨酸含量正相关。此外，添加AP后，淀粉和蔗糖代谢、其他类型O-聚糖生物合成、半乳糖代谢和氨基酸生物合成等显著富集代谢通路中多个基因表达在干旱胁迫下被直接或间接调节，进而通过改善植物根系活力、增强光合作用和调节渗透物质含量等方式，共同提高玉米的抗旱性。玉米素具有促进玉米组织细胞分裂、阻止叶绿素和蛋白质降解、保持细胞活力以及延缓植物衰老的功能^[28]。玉米素生物合成代谢通路富集结果显示，添加AP可促进干旱胁迫下玉米苗叶片细胞中的玉米素合成，推测玉米素可能也参与干旱胁迫下玉米的抗旱响应。

综上，添加AP能通过影响玉米叶片细胞多个代谢通路中的DEG表达，改变根系形态、植物营养吸收和细胞组分代谢，上调抗氧化组分活性或水平，调节干旱胁迫下玉米的氧化胁迫和渗透胁迫耐受性，进而提高玉米幼苗在干旱生境下的适生性。

对土壤中添加不同组分的玉米苗作控水干旱胁迫处理，结果显示，添加AP能明显降低干旱胁迫下玉米苗叶片细胞MDA含量，并能提高叶片细胞抗氧化酶活性；转录组分析发现了320个DEG，富集结果显示，包括植物―病原互作、淀粉和蔗糖代谢、其他类型O-聚糖生物合成、玉米素生物合成、半乳糖代谢和氨基酸生物合成显著富集6个代谢通路的41个DEG共同参与了玉米幼苗的干旱胁迫响应。