玉米是我国第一大作物，2023年全国玉米产量为28 884.2万t，北方春玉米区作为我国玉米生产的优势区域，在保障国家粮食稳定安全供给中发挥着重要作用。然而，北方春玉米区平均3~4年就会遭受一次低温冷害，随着玉米种植区域的北移东扩，区域性极端低温冷害的发生频率呈上升趋势，造成玉米减产可高达16%~32%^[1-2]，严重制约本区域玉米产量和品质提升，筛选和创制耐低温性强的玉米种质是解决此危害最经济有效的途径。

目前，国内外通常采用田间鉴定法和室内鉴定法进行玉米种质耐低温性鉴定。田间鉴定法一般通过调整播期来创造自然低温环境^[3]，这种方法可直观反映大田实际情况，较为客观，开展多年多点鉴定更具实践意义，但易受环境影响，不可控因素较多，重复性较差。室内鉴定法主要通过人工气候箱等设备控制温度、光照和湿度等条件模拟大田环境，环境干扰因素较少，具有快捷方便且结果精确可靠等优点，适用于大批量材料的初步筛选^[4]，但是无法评估基因型与环境的互作效应。总之，2种鉴定方法各有利弊，国内外研究学者通常先使用室内鉴定法初步筛选耐低温材料，然后采用田间鉴定法进一步验证，将2种方法结合来鉴定玉米耐低温性^[5]。

玉米在不同生育时期都有可能遭遇低温冷害，但在生长发育的早期对冷害胁迫更为敏感，种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数等会随着温度的降低而下降^[6-7]。张晓聪等^[8]通过低温玉米发芽试验发现，低温处理时的发芽率、发芽势及发芽指数等指标均明显下降，说明低温胁迫能够抑制种子萌发；徐婷等^[9]研究表明，低温显著影响玉米种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数等指标，不同玉米品种间的耐低温性存在显著差异；李波等^[10]对91份玉米自交系耐低温等级进行划分，不同自交系在低温条件下的发芽能力及芽的耐低温能力存在显著差异。而目前针对于玉米萌发期耐低温性指标的确定尚无统一标准，研究人员主要采用发芽率、发芽势、发芽指数及其性状相对值作为玉米萌发期耐低温性评价指标。刘杰等^[11]应用低温胁迫下种子的发芽率、发芽指数、平均发芽时间以及其相对值共6个性状对81份玉米杂交种进行耐低温性分级，提出大量材料鉴评可以采用相对发芽率作为鉴定指标；扈光辉等^[12]认为，相对发芽指数、相对发芽率、相对苗干重、相对根干重和相对根总长适合作为玉米芽期和苗期耐低温性的鉴定指标；张雪峰等^[13]认为，相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数和相对活力指数这4项指标可以作为玉米耐低温综合鉴定指标。玉米的耐低温性是由多基因控制的复杂数量性状，采用单一指标来进行评价具有片面性，应将多个耐低温性相关指标根据权重比例获得综合鉴定指标来评价玉米的耐低温能力。研究者通常联合主成分分析、隶属函数和聚类分析等方法来鉴定玉米种质资源耐低温性。郭胜微等^[14]通过主成分分析、隶属函数、聚类分析和回归分析低温胁迫下10个萌发及生长指标，对48个糯玉米品种耐低温性进行综合评价与分类。课题组前期研究^[15]结合主成分分析、隶属函数和聚类分析将13个测定指标转化为3个相互独立的综合指标，将20份玉米材料按萌发期耐低温性划分为3类。贺韵涵^[16]采用主成分分析、回归分析、聚类分析、判别式分析进行耐低温性综合评价，将247份玉米自交系分为4类。

本研究以项目创制的110份玉米新材料为试验材料，采用田间与室内鉴定相结合的模式，综合评价新材料的萌发期耐低温性，划分耐低温级别，为东华北地区玉米耐低温种质改良和新品种选育提供材料基础和技术支撑。

供试玉米新材料共110份，由黑龙江省农业科学院玉米研究所提供（表1）。

每份玉米材料选取饱满、大小一致且无破损种子，分别经75%酒精、2%次氯酸钠和无菌水表面消毒后，按照GB/T 3543.4-1995标准置于智能光照培养箱中进行避光萌发，定期补充适量无菌水。低温胁迫处理条件为5 ℃培养7 d后25 ℃培养7 d，对照处理条件为25 ℃培养7 d，每个处理3次重复，每个重复50粒种子，以玉米胚芽突破种皮0.5 cm为萌发标准，每日记录萌发数，并于培养第7天和14天分别统计对照组和处理组的发芽率、发芽势、平均发芽时间及发芽指数。

利用黑龙江省齐齐哈尔市克山县的自然生态条件，分2期播种110份玉米材料，第1期利用早春低温天气，于2023年4月25日播种（比正常播期提前10 d），第2期为适期播种（对照），于2023年5月5日播种，2次播种后及时喷灌。试验采取随机区组设计，4行区，行长5 m，单粒点播，株距10 cm，3次重复，每次重复50粒种子，田间管理同大田一致。试验期间每日记录5 cm耕层地温，田间自然低温处理种子出苗后每日精确记录出苗数，待种子出苗完成后，统计出苗率及出苗指数。

发芽率（%）=发芽种子数/供试种子数×100（25 ℃统计第7天发芽种子数，5 ℃统计第14天发芽种子数）。

发芽指数=Ʃ(G_t/D_t)，式中，D_t为发芽日数，G_t为D_t相对应的每日发芽数。

发芽势（%）=发芽初期（规定日期内）正常发芽种子数/供试种子数×100（25 ℃统计第3天发芽种子数，5 ℃统计第9天发芽种子数）。

平均发芽时间=Ʃ(D×n)/Ʃn，式中，D为从发芽试验开始计算的天数，n为第D天新萌发的种子数。

出苗率（%）=出苗种子数/供试种子数×100。

出苗指数=Ʃ(G_t/D_t)，式中，D_t为出苗日数，G_t为D_t相对应的每日出苗数。

性状相对值=XL/XN，式中，XL为低温胁迫下测得的各性状值，XN为对照条件下测得的各性

状值。

设定田间相对出苗率86%以上为耐低温性极强，70%~85%为耐低温性强，55%~69%为耐低温性中强、36%~54%为耐低温性弱，0%~35%为耐低温性极弱^[17]。

式中，X_j表示第j个指标值；X_min表示某品种第j个综合指标的最小值；X_max表示第j个综合指标的最大值；U(X_j)为第j个综合指标的隶属函数值。

式中，W_j表示第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度，即权重；P_j为各基因型第j个综合指标的贡献率。

采用Excel 2019对数据进行基本计算和处理，每个指标的测定值均为各重复的平均值。应用SPSS 19.0统计软件进行相关性分析和主成分分析，运用R软件进行聚类分析。

发芽率反映种子的发芽能力，低温胁迫处理后110份玉米新材料种子的发芽率存在显著差异（表2，P<2E-10），其中发芽率和相对发芽率均在90%以上的材料有4份，分别是DN22340、DN22355、23YM2和DN22341，说明这些材料在低温胁迫下耐低温性表现突出；由图1可知，低温胁迫下种子发芽率和相对发芽率在80%以上的材料分别有17和18份，分别占总数的15.45%和16.36%；发芽率和相对发芽率在60%以上的材料分别有28和34份，分别占总数的25.45%和30.90%；发芽率和相对发芽率均为0的材料有11份。

发芽势反映种子发芽的整齐度，发芽指数反映种子快速萌发和生长的能力。本研究中低温胁迫延迟了种子的萌发，造成相对发芽势下降，不同材料间相对发芽势的变化差异显著，由图2可知，相对发芽势达到60%的有2份材料，分别是23YM2和京XP4823；相对发芽势为0的材料有11份。低温对玉米种子的相对发芽指数也产生了较大的影响，其中，相对发芽指数排前三的材料分别是23YM2、DN22341和DN22296；相对发芽指数80%以上的材料有5份，占总数的4.55%；相对发芽势和相对发芽指数均为0的材料有11份。

110份玉米新材料萌发期室内耐低温性相关性状表型值统计见表3，相对发芽率、相对发芽指数、相对发芽势和相对平均发芽时间分布的范围较大，新材料的耐低温变异比较丰富，基本呈现正态分布。萌发期室内耐低温性相关性状方差分析见表2，结果表明，发芽率、发芽指数、发芽势和平均发芽时间4个性状的基因型间、环境间和基因型与环境互作间差异极显著，相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数和相对平均发芽时间4个性状的基因型间差异极显著。

由表4可知，110份玉米新材料适期播种（CK）和早播低温处理下的平均出苗率分别为84.18%和74.57%，低温胁迫明显降低各材料的平均出苗率。相对出苗率能够减少材料间的基因型差异，更能反映材料的耐低温性差异。不同材料间耐低温性有极显著差异，研究筛选到相对出苗率86%以上的强耐低温玉米新材料72份。110份玉米新材料适期播种和早播处理条件下的平均出苗指数分别为2.18和1.66，低温胁迫显著降低各材料的出苗指数，田间相对出苗指数对衡量材料的耐低温能力更具有代表性，本研究得到相对出苗指数均值大于86%的新材料21份。

110份玉米新材料的萌发期田间耐低温性相关性状表型统计见表4，相对出苗率和相对出苗指数分布范围较大，新材料的耐低温性变异比较丰富，基本呈正态分布。萌发期田间耐低温性相关性状方差分析见表5，结果表明，出苗率和出苗指数的基因型间、环境间和基因与环境互作间差异均达到极显著水平，相对出苗率和相对出苗指数的基因型间差异极显著。

对玉米萌发期室内和田间6个耐低温性相对指标进行相关性分析（表6）表明，相对发芽率与相对发芽指数、相对发芽势、相对平均发芽时间、相对出苗率和相对出苗指数呈极显著正相关，相对发芽指数与相对发芽势、相对平均发芽时间、相对出苗率和相对出苗指数呈极显著正相关，相对发芽势与相对平均发芽时间、相对出苗率和相对出苗指数呈极显著正相关，相对平均发芽时间与相对出苗率、相对出苗指数呈极显著正相关，相对出苗率与相对出苗指数呈极显著正相关。

利用SPSS软件对110份玉米材料的6个耐低温相对性状进行主成分分析，设置特征值大于1得出各主成分贡献率，特征向量矩阵分析结果见表7，第1主成分和第2主成分的贡献率分别为71.34%和22.86%，前2个主成分的累计贡献率为94.20%，以2个主成分得出综合评价函数，Y= 0.713Y₁+0.229Y₂。综合评价函数值（Y）与玉米萌发期耐低温性呈正相关，即Y值越大说明该材料的耐低温性越强。根据特征向量可求出主成分，第1主成分表达式为Y₁=0.46X₁+0.46X₂+0.44X₃+ 0.44X₄+0.28X₅+0.31X₆，其中相对发芽率和相对发芽指数的权重系数较大，表明第1主成分大小的决定因素主要是相对发芽率和相对发芽指数；第2主成分表达式为Y₂=0.21X₁+0.23X₂+0.25X₃+ 0.14X₄-0.66X₅-0.62X₆，其中相对出苗率的权重系数较大，说明第2主成分大小的决定因素主要是相对出苗率。

利用综合耐冷性公式得出综合耐冷评价值D值，按照D值从高到低进行排序（表8），其中23YM2的D值最大（0.99），说明其耐低温性最强，辽A79的D值最小（0.00），表现出最弱的耐低温性。采用欧氏距离法对110份玉米材料按D值进行聚类分析，可以划分为6个类群（图3），每个类群代表不同的耐低温级别。类群Ⅰ耐低温性极强，D值范围为0.74~0.99，包含27份材料，分别是LX288、龙系412、HB0012、DN22059、DN22073、DN22091、DN22199、DN22258、DN22340、DN22355、DN22383、京19B3952、23YM1、23YM2、23YM7、23YM8、23YM10、京XP4823、DN22067、DN22248、DN22296、DN22338、DN22341、DN22346、ML017、22S-256、22J-776；类群Ⅱ耐低温性强，D值范围为0.54~0.73，包含22份材料，分别是LX508、SX735、HA0002、23YM5、23YM6、J22133、22H800、22H738、DN22018、DN22028、DN22108、DN22119、DN22145、DN22299、辽5131、23YM9、J22130、中群15、中群16、DN22043、22S-218、22J-982；类群Ⅲ耐低温性中强，D值范围为0.38~ 0.52，包含22份材料，分别是TWS49、T96、HB0011、东502、23YM3、TP7、22H770、22H712、CA135、DN22221、DN22244、DN22287、吉A144、吉A8401、吉A92、辽2180、京2418、辽8013、中综6号、京XP4816、京XP4826、DN22309；类群Ⅳ耐低温性弱，D值范围为0.25~0.35，包含21份材料，分别是东601、23YM4、T3469、22H548、吉A43、吉A2102、059、辽81、CA109、CA9B1、DF301、吉A2081、吉A195、吉A861、吉A5080、辽8001、辽8015、辽1112、京21D2934、ML012、16G1638；类群Ⅴ耐低温性中弱，D值范围为0.10~ 0.22，包含16份材料，分别是东303、辐1001、吉A1001、辐1002、吉A65、20G70、吉A316、吉A251、吉A192、吉A1683、吉A533、吉A544、吉A566、辽8002、京21D2982、京21D2935；类群Ⅵ耐低温性极弱，D值为0.00~0.10，包含2份材料，分别是辽A79和ML009。

玉米萌发期耐低温种质鉴定和筛选，需要明确适合的胁迫温度，温度过高难以区分材料间的耐低温差异，而温度过低则易导致玉米幼芽生长发育停止甚至死亡。研究^[18]表明，玉米种子萌发所需最低温度为5~15 ℃。有研究^[19]表明，5 ℃低温胁迫处理时耐低温性强的玉米材料的株高及株重显著高于耐低温性弱的玉米材料。课题组前期研究^[20]在室内鉴定不同温度对玉米发芽率的影响，结果表明在5 ℃处理下不同玉米品种的发芽率差异极显著。德国KWS公司则以5 ℃（4 d）~ 25 ℃（6 d）条件下的发芽率来评价玉米萌发期的耐低温性^[21]。因此，本研究选择5 ℃作为玉米萌发期室内耐低温性鉴定的胁迫处理温度。前人^[22]研究多选用10 ℃左右的温度作为玉米萌发期田间低温胁迫处理温度，王欢^[22]在10 ℃条件下对70份玉米新材料进行筛选，鉴定出耐冷性极强玉米新材料9份；李红飞等^[23]以10 ℃作为筛选条件，从654份玉米新材料中筛选出耐低温性强的材料30份和低温敏感的材料43份。因此，本研究选择4月25日进行早播处理，据分析4月25日-5月10日地下5 cm的地温变化范围在4.55~13.85 ℃，平均低温为10 ℃左右。

玉米萌发期和苗期的耐低温性呈正相关，本研究中室内相对发芽率为0的材料田间出苗率均低于55%，耐低温性表现为弱和极弱，室内鉴定与田间鉴定结果的一致性说明采用2种鉴定方法相结合评价玉米种质耐低温性，避免了室内或田间单一环境所产生的误差，可以精准评价耐低温优异新种质。本研究中室内低温胁迫处理后，有11份材料发芽率为0，分析原因一方面是鉴定的玉米新材料中存在因遗传差异而造成的耐低温性差异，另一方面玉米不同生育期的耐低温机制不同，本研究结果仅针对萌发期的耐低温性鉴定，此外，研究过程中个别材料种子因染菌而抑制萌发导致发芽率数据存在误差，后续研究中需要进一步优化种子消毒方法。

玉米耐低温性是由多基因和外界环境对其协同控制的复杂数量遗传性状^[1]，不同种质间耐低温性存在差异，仅采用单个指标难以准确鉴定评价，因此常选用与耐低温性关系密切的多个指标进行综合评价。种子室内萌发过程中，发芽率、发芽势和发芽指数因能够反映种子的发芽速度、发芽整齐度及种子的发芽能力，常作为评价种子综合活力的指标^[8]，田间鉴定时，多以发芽率、田间出苗率和田间出苗指数作为筛选耐低温玉米种质的指标^[24-25]。本研究中，为减少材料遗传背景差异引起的误差，真实反映耐低温性，选取相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数、相对平均发芽时间、相对出苗率和相对出苗指数共6个相对性状对110玉米材料进行主成分分析和聚类分析，综合评价耐低温能力。目前，大多数作物以耐低温相关指标的主成分分析、隶属函数分析及聚类分析，综合评价耐低温级别^[26-27]。韩冬伟等^[28]利用主成分分析对66份玉米杂交种进行耐低温性综合分析，筛选出耐低温性强的材料12份；李进等^[29]对低温胁迫下4个棉花品种7个测定指标进行主成分分析，发现不同品种间耐低温能力存在显著差异；王成等^[30]对20份玉米种质资源开展耐低温性鉴定，通过聚类分析，将新材料耐低温性分为3类，筛选出耐低温性较强的新材料5份；张晓聪等^[8]在玉米芽期耐低温性鉴定中，通过聚类分析将材料划分为3类，其中PH4CV、吉419和吉495耐低温性最强。本研究通过主成分分析将110份玉米新材料的6个单项指标综合成2个相互独立的综合指标，2个主因子累计贡献率达到94.20%，发现相对发芽率、相对发芽指数和相对出苗指数可以当作鉴评材料耐低温能力的关键指标，综合聚类分析，较为科学地将110份玉米新材料划分为6个耐低温等级，而同一类群中存在不同耐低温等级的玉米新材料，说明耐低温性与其所属类群无必然联系，通过有效的遗传改良可以提高玉米种质的耐低温性。

采用田间鉴定与室内鉴定相结合的模式，统计萌发期低温胁迫处理下110份玉米新材料12个耐低温性相关指标，结果表明相对发芽率、相对发芽指数和相对出苗指数可作为玉米萌发期耐低温性鉴定的重要参考指标。通过聚类分析将110份玉米新材料划分为6个耐低温等级，其中，耐低温性极强的有27份，耐低温性强的22份，耐低温性中强的22份，耐低温性弱的21份，耐低温性中弱的16份，耐低温极弱2份。