在工业生产上，一般要求烟叶中的烟碱含量适中，其与糖类等化学成分的比例和协调性在很大程度上决定了烟草的质量。烟碱是由氨基酸代谢产生的一种次生代谢物，其中脯氨酸直接参与烟草根系烟碱的合成^[1]，其含量的高低对烟碱合成有较大的影响。肥料是影响烟碱含量的主要因素，其中氮肥对烟草生长和烟碱积累的影响最大^[2]。研究表明，施氮量越多，烟叶中烟碱含量越高，二者呈极显著正相关关系^[3]；减少土壤中氮的含量及降低氮肥含量均可降低烟叶烟碱含量^[4]。

再者，施氮时间也会影响氮素在烤烟根际的迁移及有效性，进而影响烟株体内氮代谢水平及烟碱合成。推迟氮肥的施用时间有利于提高生育后期土壤氮含量，与一次性基肥相比，分次施用显著增加了烤烟上部烟叶中烟碱含量。此外，由于不同植烟区的光热水资源不同，不同施肥方式对烤烟氮肥的利用率存在显著差异^[5]。事实上，烤烟在不同生育时期对氮素养分的需求是不同的，通过调节有效氮的供应量和时间来满足烟株正常营养生长和适宜含量的烟碱就显得尤为必要。

广东韶关烟区的烟叶属于焦甜醇甜风格，表现出低糖高碱的规律，目前生产中的问题是上部烟叶烤后的烟碱含量经常低于2.5%，中部烟叶烟碱含量则常低于1.8%，从而严重影响韶关产区烟叶风格特征及其工业可用性。在韶关烟区调研发现，当地农户为了减少人工成本的投入，往往在移栽时加大基肥比例和减少追肥次数；再者，烟叶生长中后期产区雨水较多，土壤养分流失较严重，致使烟株生长后期脱肥，进而影响到烟碱的合成和积累，最终导致烟碱含量偏低。

鉴于此，本研究以粤烟1号为材料，在韶关产区以农户常用的施氮量及基追比为对照，设置了不同施氮量和不同基追比双因素大田试验，探究施氮量与基追比对烤烟生长和烟碱合成、积累及关键酶活性的调控效应，探寻提高烤后烟叶烟碱含量的可能施氮方法，为解决韶关烟区烤后烟叶烟碱含量偏低问题提供理论依据和实践参考。

试验于2022年在广东省烟草科学研究所南雄研究所生产基地进行，供试土壤为典型植烟土壤牛肝土，前茬作物为水稻。土壤基本理化性质为pH 7.61、有机质26.18 g/kg、全氮1.60 g/kg、全磷0.92 g/kg、全钾21.50 g/kg、碱解氮75.19 mg/kg、速效钾164.32 mg/kg、速效磷43.67 mg/kg。供试烤烟品种为广东省烟草科学研究所提供的粤烟1 号。

试验采用裂区试验设计，施氮量（A）为主因素，设135（A1）、165（A2，当地常规施氮量）和195 kg/hm²（A3）3个水平；基追比（B）为副因素，设3:7（B1）、5:5（B2）、7:3（B3，当地常规基追比）3个基追比，共9个处理，其中A2B3处理为农户常规施肥方式，每个处理3次重复，共27个小区，每个小区植烟36株。2021年11月播种后进行漂浮育苗，2022年2月17日进行膜下移栽。基肥于移栽前穴施，追肥分别于提苗期、培土前、移栽后45 d、打顶后分4次施入，详细施肥方案见表1。打顶方式为扣心打顶，留叶数范围为18~20片。其余田间管理措施按当地产区优质烟叶生产技术规范进行。

移栽前取0~20 cm土层土壤，用于测定土壤理化特性等指标。采用水浸提电位法^[6]测定土壤pH，风干后土样与水1:2.5混匀，搅拌震荡20 min，利用ST2100型酸度计测量土壤pH。采用碱解扩散法测定碱解氮含量；用醋酸铵浸提后采用原子分光光度计的火焰分光光度法测定速效钾含量；采用钼锑抗比色法测定速效磷含量。

在移栽后60（旺长初期）、75（打顶初期）和90 d（下部叶采收当天）时，每个处理选择3株长势一致的烟株，分别取其上、中、下部烟叶，用水冲洗干净后擦干，并做好标记，于105 ℃杀青30 min，65 ℃烘至恒重后称量，记录各部位烟叶干物质积累量。

分别于移栽后75（打顶初期）、90（下部叶采收当天）、105（中部叶采收当天）和132 d（上部叶采收当天）上午，每个处理按小区随机选取代表性烟株3株，用挖土法采集根系，以取样烟株茎基为中心，按50 cm（长）×40 cm（宽）×40 cm（深）的尺寸挖土取根，将挖出的土块和整株根系放入盛有清水的桶中进行淘洗，反复经孔径0.5~1.0 mm的土壤筛过滤，清洗干净后再用去离子水润洗一遍，将烟株根系从茎基部切离，采集新鲜根系（含清洗过程中散落的根系），部分鲜根用于根系活力和脯氨酸分析，部分放入-80 ℃液氮中保存，用于烟碱合成与转化的关键酶活性测定。其余根系与清洗干净的茎叶分别装入铝盒中，于105 ℃杀青30 min，然后转入85 ℃烘干24 h至恒重，冷却后称重，计算烟株根系生物量^[7]和地上部干物质积累量。

用TTC法^[8]测定根系活力，用酸性茚三酮比色法^[9]测定脯氨酸含量。

采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA），测定根系烟碱合成和转化过程中的精氨酸脱羧酶（ADC）、鸟氨酸脱羧酶（ODC）、腐胺N-甲基转移酶（PMT）、烟碱-N-去甲基化酶（NND）和亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR1）活性。

每小区随机选取烤后B2F（上桔二）、C3F（中桔三）等级各9片，放入60 ℃烤箱烘干后，剔除主脉和较粗的支脉，粉碎过100目筛后，参考郑璞帆^[10]方法并稍作改动，采用HCl浸提法测定烟碱含量。称取粉碎过筛烘干的烟叶样品0.03 g，加入0.5 mol/L盐酸溶液25 mL，活性炭1/3角匙，震荡10 min后过滤，定容至100 mL，用紫外分光光度计测定236、259和282 nm的吸光度。

用Excel 2016计算数据和制作表格，用SPSS 20进行数据统计学分析，用Origin 2023绘制统计图。

由图1可知，根系生物量从移栽后75~90 d呈上升趋势，在移栽后90~132 d呈下降趋势。同一施氮量下基追比的增加显著降低根系生物量，3种施氮量下基追比为3:7的处理根系生物量最大，其中A3B1处理下根系生物量在不同生育时期均最大，根系生物量分别达116.98、164.64、151.46、145.72 g/株。

由图2可知，施氮量及基追比对根系活力的影响与根系生物量的变化趋势基本一致，施氮量的增加显著提升了根系活力，同一施氮量下基追比3:7处理的根系活力最大，氮肥基追比的升高使根系活力明显降低，移栽后90 d各处理的根系活力达到峰值，随后随着生育时期推进，根系活力逐渐降低，到移栽后132 d，A1施氮量水平下基追比为7:3（B3）处理的降幅最大。农户常规施肥方式（A2B3）在各生育时期的根系活力均显著低于A2B1和A2B2，这表明氮肥后移利于烟株根系保持较高活力。

由图3可知，各处理烤烟根系Pro含量的变化规律基本一致，各生育时期均是A3B3处理的Pro含量最大，并在移栽后105 d根系Pro含量最大，随后降低，究其原因可能与此时段高强度降水影响土壤环境有关。同一施氮量水平下基追比对根系Pro含量有显著的影响，随着基追比的增加Pro显著升高；而在相同的基追比条件下，增加施氮量也明显提高Pro含量。

由图4可知，烤烟根系中的ADC、ODC、PMT的活性均随着生育时期的推进呈先上升后下降的趋势，各处理的酶活性于移栽后105 d达到峰值。施氮量及基追比对ADC和ODC活性的影响规律基本一致，随施氮量的增加，二者活性明显增加；同一施氮量水平下，随氮肥基追比的增加，二者活性也显著上升。然而，PMT活性的变化却与之不同，其活性虽随着施氮量的增加有所增加，但是随着基追比的增加其活性降低幅度更大，这表明氮肥的基追比对PMT活性调控效应更为显著，基氮肥后移利于PMT活性增加和根系烟碱的合成。

由图5可知，随着生育时期的推进，根系NND和MTHRF1活性呈先上升后下降的趋势，并于移栽后105 d达到峰值，其活性明显受到施氮量及其基追比的影响。农户常规施肥方式（A2B3）下根系NND和MTHRF1活性在各生育时期均高于其他处理，在同一施氮水平下，基氮肥后移，即降低基追比可显著降低NND和MTHRF1活性，这说明农户常规施肥方式有利于根中烟碱分解，从而会降低根中烟碱含量。在相同的基追比下，适当增加施氮量，NND和MTHRF1活性会明显升高，但过多的氮肥会使活性有所降低。

图6是各部位烟叶在移栽后75和90 d的干物质量变化，均表现为下部叶>中部叶>上部叶的规律，各部位烟叶的干物质量均随着施氮量的增加而增加，而在同一施氮量水平下，随基追比的增加各部位烟叶干物质量明显降低，因此，各部位烟叶均在施氮量为A3、基追比为B1水平下干物质量最大，上、中、下部烟叶干物质量于移栽后75 d分别达5.57、8.14和10.02 g，到移栽后90 d各部位烟叶干物质量迅速增加，其中A3B1处理的上、中、下部位烟叶干物质量相比于移栽后75 d分别增长了3.67、3.01和3.59 g。

由表2可知，根系烟碱含量和积累量从移栽后75到90 d表现为增加趋势，在移栽后90 d达到峰值后开始下降；施氮量、基追比及二者交互作用显著影响各处理根系烟碱含量和积累量，增施氮肥和基氮后移均有利于根系烟碱的积累。其中A3B1处理的根系烟碱含量和积累量于移栽后75、90、105、132 d均表现为较高，烟碱含量分别达到6.10、12.30、11.29和9.00 mg/g，烟碱积累量分别为408.44、2025.34、1711.45、1311.28 mg/株。

由表3可知，各部位烟叶烟碱含量随生育时期的推进逐渐增加，烟碱含量呈现上部叶>中部叶>下部叶的规律，均随着施氮量的增加各部位烟叶烟碱含量显著提高，而基追比的增加会显著降低其含量。移栽后75 d时，A3B1处理的上、中、下部叶的烟叶烟碱含量比最低的A1B3处理分别增加了2.41、2.38和2.93 mg/g。

由图7可知，施氮量和基追比显著影响了烤后上、中部烟叶烟碱含量和积累量，施氮量的增加和基氮后移有利于烤后上、中部叶的烟碱含量和积累量，以A3B1处理最高，烟碱含量分别为29.68和27.56 mg/g，高于上、中部叶烟碱含量最低的A1B3处理（7.69和12.04 mg/g）；其中A3B1处理的上、中部叶烟碱积累量分别为1921.06和1843.64 mg/株，显著高于其他处理。

本研究发现增加施氮量和基氮后移可显著提升烤后中、上部叶烟碱含量，这与陈顺辉等^[11]、李文卿等^[12]和毛家伟等^[13]研究中氮素施用会促进烟碱合成的结果一致，可能是增加施氮量能够促进烟株对氮素的吸收，氮素同化作用和光合作用加强，碳氮代谢增强；但与周效峰等^[14]研究中在施氮量为195 kg/hm²和基追比3:7的情况下烟叶烟碱含量随着施氮量的增加呈先下降后上升的趋势有所不同，可能与本试验设计的施氮量起点较高及主栽品种、施肥次数及方式不同有关。本试验在烟株旺长前后存在降水较多的情况，虽然一定量的降水可以溶解肥料并促进根系吸收，但是低氮和高基追比处理在降水次数多且强度较高的情况下，有可能存在雨水冲刷导致土壤氮淋失的现象，不仅不能供给根际周围养分，还会对根系造成一定影响，进而影响地上部分生长。地下部的根系生物量和根系活力随着施氮量的增加而增加，随着基追比的增加而降低，这与邹文桐等^[15]研究一致，但与宗钊辉等^[16]研究中较低施氮水平具有较高的根系活力、深层土壤根系更发达，但降低烟株根系生物量积累与地上部干物质量的结果有所不同，究其原因可能是在韶关烟区相同施氮量条件下，随追肥比例增加，根系活力较高，烟株对追肥氮的吸收量增大，对基肥氮的吸收量减小，这一点与石玉等^[17]在小麦上的研究结果类似。值得注意的是，移栽后90 d各处理根系烟碱含量和积累量达到峰值，其原因可能与移栽后75 d烟株打顶有关，此时根系生物量迅速增加，根系烟碱合成能力开始增强，移栽后90 d时根系生物量达到峰值，因而根系烟碱含量和积累量达最大值。

试验中根系Pro和ODC随着施氮量及基追比的增加而增加，在基追比为7:3的情况下达到最大，究其原因可能是较多的基肥虽然可以避免人工追肥的滞后性，但是在基肥作为固体肥料的情况下，完全溶解供给烟株吸收需要较长时间，且容易在根际周围形成逆境，导致根系Pro浓度上升，而作为合成Pro的前体物之一的ADC和ODC活性增加，与根系烟碱的合成共同瓜分底物ADC和ODC，导致根系烟碱合成力降低，根系烟碱含量降低，从而运输到地上部分的烟碱物质随之减少，但是烟碱相关的转化酶NND和MTHRF1的活性则随着施氮量的增加先升后降，随着基追比增加而增加。在施氮量为195 kg/hm²和基追比7:3处理下根系的Pro含量较高，其合成的ADC和ODC活性增加，但是根系烟碱含量依然高于低施氮量，可能是施氮量增加导致根系生物量增加，与烟碱合成能力同步增强呈正比。烟碱合成途径中的关键酶PMT活性随着施氮量的增加而增加，随着基追比的增加而降低。究其原因是韶关烟区在烟株生长中、后期降雨和田间积水较多，烤烟采用起垄栽培，在多雨地区容易产生氮肥在地表径流和养分淋溶的现象，降低氮肥利用率，其次在较低施氮量下，土壤含氮量低，由于水分的稀释效应会降低根系对氮的吸收，从而影响到烟碱的合成，而在较高施氮量下，氮的增加降低了水分稀释效应，促进了氮的吸收和根系烟碱的合成，因而地上部烟叶烟碱含量升高。

综合以上分析可以得出，在韶关烟区不同施氮量及基追比对烤烟烟碱含量影响显著，但需要强调的是本试验中在施氮量为195 kg/hm²和基追比为3:7的条件下其烤后烟叶烟碱含量达到了正常烟碱含量要求范围内，这些试验结果是与韶关产区烟叶生长中后期具有较多降水量和降水天数有密切关系，而不同产区由于烟叶生长季节气候有较大的不同，因而在实际生产中要根据产区当地当年的气候条件进行适当调整，以防过高施氮带来不利影响。

在当地农户习惯施氮量水平和基追比的基础上，适当增加施氮量和基氮后移，即施氮量为195 kg/hm²和基追比3:7有利于根系Pro浓度降低，显著增加根系生物量和根系活力，提高根中PMT活性，降低NND和MTHRF1等烟碱转化途径中相关酶活性，从而增加根系烟碱含量，利于地上部的烟叶干物质量、烟碱含量和烟碱积累量增加，最终烤后上、中部叶的烟碱含量分别达到29.68和27.56 mg/g，使其显著高于农户习惯施肥方式下的烟碱含量，但也保证其处于烟叶正常的烟碱含量范围内。