吉林省白城市通榆县位于中国东北部，土壤风沙盐碱化严重，该地区由于过度放牧和开垦、不合理耕作种植等人为因素和季节性降水分配不均、强风频繁发生等自然因素，导致农牧交错带土壤沙化日益严重，土层变薄，土壤质量逐年下降，严重影响该地区农作物的产量和区域农业的可持续发展^[1-2]。有研究^[3-5]表明，轮作等种植方式不仅可高效利用土地资源，增加轮作系统产量，还可有效改善土壤物理、化学和生物特性，缓解连作障碍。朱亚琼等^[6]研究发现，与单作相比，豆科绿肥与玉米、油菜间混作以及轮作均可提高土壤养分含量。Naab等^[7]研究发现，使用轮作、间作等保护性耕作方式能够实现经济回报和土壤肥力的双赢。虽然当前轮作已经被证明对土壤的理化指标有积极影响，但轮作对风沙盐碱脆弱生态区土壤微生物群落的影响尚不明确。

玉米（Zea mays L.）作为我国重要的粮食和饲料作物，对保障粮食生产起到重要作用^[8]。花生（Arachis hypogaea L.）作为我国主要的油料和经济作物之一，具有耐瘠薄、固氮、经济效益高等特性，在我国河南、山东、河北等地区广泛种植^[9]。谷子（Setaria italica）又称粟，是我国传统的粮食作物，距今已有逾8000年的栽培历史，具有抗旱、耐瘠薄、营养丰富等特点，是我国居民膳食结构的主体作物^[10]。因通榆县当地特殊的自然气候和地理条件，农业种植结构较为简单，作物主要有玉米、花生和杂粮。但近年来受粮食价格和集约化种植影响，通榆地区农户多选择种植经济效益较好且机械使用度较高的玉米作为主栽作物^[11]。然而，相关研究^[12]表明，由于常年单作、连作和过量施用化肥，导致连作障碍日趋严重，阻碍了作物产量和品质的提高，还破坏了土壤微生物群落的生态稳定性和环境可持续性。因此，为解决玉米连作可能造成的潜在威胁，结合当地现有的种管收配套农机设备，选择适宜的轮作组合对维持健康的土壤微生态至关重要。

微生物在农业系统中发挥着重要的作用，以往研究^[13]表明，耕作是改变微生物群落结构的主要因素。也有研究^[14-15]表明，微生物群落多样性会受到土壤理化性质的影响，且现在作物的多样化也被认为是土壤微生物群落变化的重要驱动因素。但玉米轮作（CR）和玉米连作（CC）在不同耕层土壤的微生物群落丰度、多样性和结构的差异尚不清楚。

因此，本研究利用Illumina Miseq高通量测序技术，通过分析玉米―花生―谷子轮作（CR）和玉米连作（CC）种植模式下不同耕层土壤的微生物群落结构多样性及玉米产量和效益差异，以期为玉米轮作技术的推广和当地农业可持续健康发展提供理论依据。

本研究于2020年在吉林省白城市通榆县哈拉道村进行田间定位试验。该地区属于中温带半干旱大陆性季风气候，四季分明，年均日照时数2900 h，年均气温5.5 ℃，年均降水量350 mm，无霜期约164 d，春季多风，季节性降水不均。一个轮作周期（3年）后，于2022年采集土壤样品分析测试。试验地试验前（2019年）土壤有机质1.17%、全氮580.6 g/kg、速效磷3.75 mg/kg、速效钾50.6 mg/kg、pH 8.37。

采用大区生产试验设计，共设2种种植方式，分别为玉米―花生―谷子三区作物轮作（CR）和玉米连作（CC）。供试玉米品种为富民985，试验地块前茬作物为玉米。玉米连作（CC）试验地面积为1 hm²，玉米轮作（CR）试验地面积为2 hm²（该轮作地块于2020年种植花生，2021年种植谷子，2022年种植玉米）。试验地块玉米于2022年4月28日进行播种，垄间距为65 cm，播种密度为7.8万~7.9万株/hm²，保苗7万株/hm²；底肥施加560 kg/hm²的氮磷钾复合肥（N:P:K=26:15:15）。采用水肥一体化方式，分别于玉米拔节期和吐丝期每次追施尿素200 kg/hm²（N≥46%）。

于2022年10月作物收获后、冻土前，分别采集轮作玉米和连作玉米0~20 cm和20~40 cm耕层土壤，采集器材使用前消毒，每个处理随机选取3个点，作为3次重复，剔除砾石和植物残根等杂物，一部分新鲜土样装入5 mL灭菌离心管，置于干冰中贮藏，低温运输至北京奥维森基因科技有限公司完成相关测试；另一部分自然风干，用于测定土壤养分。

采用DNA抽提试剂盒提取土壤基因组DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和质量，高通量测序使用338F（ACTCCTACGGGAGGCAG CAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）对细菌16S rRNA基因的V3~V4高变异区进行PCR扩增，对真菌ITS区域ITS1F（CTTGGTCAT TTAGAGGAAGTAA）和ITS2R（TGCGTTCTTCA TCGATGC）进行扩增。PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60s，30个循环；然后72 ℃稳定延伸7 min，最后4 ℃进行保存，用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒纯化。

土壤微生物高通量测序在Auwigene公司（北京）的Miseq平台上进行，使用Trimmomatic、Pear软件对原始双端序列去杂，去杂后的双端序列利用Flash、Pear软件拼接，下机数据（Raw PE）在去除条码（barcode）和引物（primer）并拼接后得到原始序列数据（raw_tags），经进一步去除嵌合体、短序列后得到优质序列（clean_tags）。通过Qiime平台，采用Vsearch软件，将序列相似度大于或等于97%归为一个OTU单元。采用blast或RDP Classifier等方法对OTU代表序列进行比对分析，注释其群落的物种信息。

利用Microsoft Excel 2021以及SPSS 21.0进行数据分析，运用Illustrator Portable和GraphPad Prism 8.0绘图。土壤微生物高通量测序数据基于奥维森基因科技公司（北京）的Miseq平台（http://218.2.224.234:8888/）进行分析。

通过奥维森基因科技公司Illumina MiSeq高通量测序平台进行测序，对细菌16S rRNA基因V3~ V4区测序，所有样本共得到1 230 885条有效序列，平均长度在400~440 bp。经过筛选之后，轮作玉米0~20 cm（CR1）和20~40 cm土层（CR2）、玉米连作0~20 cm（CC1）和20~40 cm土层（CC2）土壤样品分别得到了386 849、416 448、201 046、226 542条有效序列。

对真菌rRNA（ITS1-ITS2）区测序，共得到了1 327 320条有效序列，平均长度在200~260 bp。经数据预处理最终得到的优质序列分布统计，轮作玉米0~20 cm（CR1）和20~40 cm土层（CR2）、连作玉米0~20 cm（CC1）和20~40 cm土层（CC2）土壤样品分别得到了307 505、270 009、385 336、364 470条有效序列。2种处理4个土层的细菌（图1a）和真菌（图1b）稀释曲线图可以看出其趋势逐渐平缓，说明该测序深度覆盖了样品中绝大部分细菌和真菌类型，表明测序量合理，可以用来反映微生物的群落结构。

基于基本分类单元（OTU）统计的维恩图结果（图2）显示，12个土壤样品共产生26 840个OTU。轮作玉米（CR）与连作玉米（CC）土壤0~ 40 cm耕层中共有OTU 3873个，代表吉林省风沙盐碱地区种植玉米后土壤0~40 cm耕层中稳定存在菌种。CC1、CR1、CC2、CR2特有的OTU数目分别为4685、5029、1986和3499，CR与CC相比特有的OTU数目在0~20 cm和20~40 cm土层中均表现出较高的数值，这可能与轮作年限中作物的种类增加有关。因此，受种植方式的影响，轮作玉米与连作玉米两者的0~40 cm耕层中细菌群落均出现新种属，单从OTU来看，趋同和变异共存，微生物群落组成结构发生复杂而微妙的变化。

群落生态学中研究微生物多样性，通过单样品的多样性分析（Alpha多样性）可以反映微生物群落的丰度和多样性，包括一系列统计学指数，用于反映和估计环境群落的物种丰度和多样性^[16]。Coverage指数可以反映测序的覆盖程度，其数值越高，表示样本中序列被测出的概率越高，没有被测出的概率越低。Chao1指数反映物种丰富度；Shannon指数反映群落多样性；Simpson指数反映物种优势度；PD全树谱系多样性，是兼顾了物种丰度以及进化距离的多样性指数，是基于系统发育树来计算的一种多样性指数，它用各个样品中OTU的代表序列构建出系统发育树的距离，将某一个样品中的所有代表序列的枝长加和，从而得到的数值，数值越大，群落多样性越高。

各处理的测序覆盖度均达到了0.92以上，说明测序深度足够（表1）。试验结果显示，各处理的土壤细菌丰度远大于真菌，其中CR1的细菌群落Chao1指数最高，CC2最低，0~40 cm土层CR处理细菌Chao1指数比CC处理平均高22%；Shannon指数最高的是CC1处理，CC2最低，Shannon指数的降低是由于均匀度降低所致，反映了轮作体系内虽然增加了微生物群落的丰富度，但是均一性并不高，说明轮作体系增加了某些特殊的微生物物种。单独考虑耕层深度，0~20 cm土层Shannon指数较20~40 cm土层高8%。PD全树谱系多样性和实际观测物种数结果均表现出CR1>CC1>CR2>CC2，说明CR处理的物种丰富度较CC处理更高。但对于物种丰富度而言，在相同的耕层中不同的种植方式并没有显示出更高的物种丰富度数值变化。0~20 cm和0~40 cm土层中物种丰富度出现显著差异，表明0~20 cm耕层CR处理的细菌群落的丰富度和多样性更为复杂。综上所述，三区轮作玉米种植方式较连作玉米相比增加了细菌群落的丰富度和多样性。但就真菌而言，真菌群落的丰富度和多样性几乎未受到轮作种植方式的影响，对不同耕层深度的响应也不敏感。

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种对数据进行简化分析的技术，这种方法可以有效地找出数据中最“主要”的元素和结构，去除噪音和冗余，将原有的复杂数据降维，揭示隐藏在复杂数据背后的简单结构。如样本组成越相似，反映在PCA图中的距离越近。不同处理下土壤中细菌OTU主成分分析结果（图3a）显示，各处理间彼此相距较远，说明在不同耕层中轮作种植方式均形成了与玉米连作不同的细菌群落结构。但就真菌群落而言（图3b），群落结构对不同耕层深度并不敏感，而对不同种植方式的响应较为明显。

4种处理的土壤细菌群落在门水平上（图4a和表2），放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）为4种处理共同的优势菌门，占总OTU的87.98%~ 91.92%。其次是一些平均相对丰度为1%~5%的次要菌门，包括厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）等。其中放线菌门在各处理之间含量最高，各处理之间表现出CC2>CC1>CR2>CR1，占比分别为36.53%、35.04%、32.84%和29.60%。变形菌门为第二优势菌门，占比分别为CR1（25.80%）、CC1（24.61%）、CC2（19.26%）、CR2（19.08%）。酸杆菌门是第3位优势菌，占比分别为CR2（17.27%）、CC2（14.87%）、CR1（15.41%）、CC1（13.09%）。除此之外，CR处理的硝化螺旋菌门和厚壁菌门占比大于CC处理。

就真菌（图4b和表3）而言，子囊菌门（Ascomycota）为绝对优势菌门，占总OTU的68.50%~88.25%。其他平均丰度>1%的包括担子菌门（Basidiomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、虫霉门（Entomophthoromycota）、壶菌门（Chytridiomycota）和球囊菌门（Glomeromycota）。子囊菌门（Ascomycota）在各处理之间表现出CR1>CR2>CC1>CC2，占比依次为88.25%、79.03%、73.61%和68.50%。担子菌门占总OTU的9.02%~ 25.42%，各处理之间表现为CC2>CC1>CR2>CR1，占比依次为25.42%、22.54%、11.43%和9.02%。综上所述，与CC处理相比，CR处理增加了子囊菌门的丰度，但降低了土壤中担子菌门的富集。

如表4所示，与连作处理相比，轮作对玉米产量提升有促进作用。轮作玉米比连作玉米增产32%。轮作玉米的变异系数和稳定性系数（SYI）分别为2.29%和0.94，变异系数与连作处理相比降低了38.27%，稳定性系数增加了4.44%。说明轮作玉米相对较为适应复杂环境变化所带来的影响。轮作模式作物种类的多样化与单一连续种植玉米相比，增加了作物的产量，降低了产量的年际间变异率，增加了年际间的产量稳定性，证明作物轮作的多样化减轻了极端天气的影响，并提高了产量稳定性。

如表5所示，各处理在年际间各部分生产投入存在差异。与2020和2021年相比，2022年各处理的平均投入总成本最高，其中2020年种植玉米生产总投入仅为12 572元/hm²，2022年种植玉米生产总投入为15 200元/hm²，较2020年种植相比成本增加了20.9%，这主要与地租和肥料农药等投入因素单价上涨有关。除此之外，CR模式中种植花生的生产投入成本在各年际间均表现为最高值，种植谷子的生产总投入最低，在相同年际间种植花生的生产投入成本是种植谷子的1.21~ 1.27倍，主要与花生种子的价格较高和谷子肥料农药投入费用较少有关。总体来看，综合考虑发现，CR模式的生产投入成本平均值与种植3年CC模式投入成本平均值相当。

如表6所示，不同处理轮作周期内经济指标共涵盖了种植的投入成本、产量、市场价格、总产值、净产值及产投比等关键指标。不同处理各项指标随年份变化和种植作物的种类不同而产生波动。在2020年，轮作玉米的成本投入为12 572元/hm²，产量为12 944 kg/hm²，价格为2.32元/kg，总产值30 030元/hm²，净产值17 458元/hm²，产投比为238.87%，在2020年各处理间表现为最高值；轮作花生投入略高（13 795元/hm²），产量相对较低，导致2020年轮作花生的产值、净产值和产投比低于轮作玉米。2021年轮作玉米产值最高，但由于种植花生的成本投入较高导致净产值与连作玉米基本持平。2022年轮作玉米产值为19 935元/hm²，在各处理间表现为最高值，高于连作玉米49.87%。轮作玉米在经济效益方面略优于连作玉米，3年平均的产投比为240.85%，高于连作玉米的182.21%。综上所述，该轮作模式不仅能提高作物产量和土地利用效率，还能降低生产投入，提高经济效益，为该地区的农业可持续发展提供了有价值的参考。然而，实施轮作模式时需考虑土壤、气候、市场价格和农业政策等因素，以制定最佳种植策略。

众所周知，土壤微生物在维持土壤健康方面起着关键作用。近年来，致力于农业技术方法对土壤微生物群落影响的研究工作正在成倍增长^[17]。然而，要明确具体哪个因素对土壤微生物群落结构和多样性产生影响，仍然是很困难的。微生物群落响应不同因素所产生的变化，因所研究的土壤类型、气候条件、种植方式、取样时间和取样深度等因素而发生变化。尽管如此，评估适应当地农业长远发展的不同种植模式下的不同耕层土壤中微生物群落变化，可为了解当地农业土壤生态环境、更好地指导当地生产提供实践和理论依据。

在本试验结果中，各处理的土壤细菌丰度远大于真菌丰度，这与Yang等^[18]的土壤中微生物以细菌为主的结论相同。微生物群落的结构和组成会随着种植方式、耕层的深度产生变化。对于细菌而言，轮作组合增加了细菌群落的丰度和多样性，但结果并不显著。Navarro-noya等^[19]发现，不同的种植制度（连作玉米与玉米―小麦轮作）对土壤微生物群落没有造成影响。伏云珍等^[20]研究发现，与单作玉米相比，玉米与马铃薯间作提高了玉米根际细菌多样性指数和丰富度指数，但差异不显著。本研究中，与20~40 cm耕层土壤相比，种植玉米后0~20 cm耕层土壤对细菌多样性影响显著，这可能由于土壤表层中的有机碳和氧气的可用性普遍较高，土壤表层中的深度也会对细菌群落丰富度和多样性产生影响，需要后续结合土壤理化指标进一步分析验证^[21]。对于真菌而言，从主成分分析结果中观察到，CR处理与CC处理的距离较远，说明CR形成了与CC相对独特的微生物群落结构，进一步说明轮作作物的多样化对土壤微生态产生了影响。

从细菌群落门水平上的分布来看，各处理共同的优势菌门大致相同，但是各门类细菌的丰度大小存在差异。其中放线菌门在各处理间含量最高。Jangid等^[22]在不同类型的耕作土壤中发现，变形菌占有绝对优势，与本研究的结果略有不同。在本研究中，各处理间放线菌门均为主要的优势菌门，这与许小虎等^[23]研究的小麦和玉米间作体系中放线菌门丰度最高（29.94%）的结果一致，出现此结果可能与土壤类型和作物种类相关，后续仍需进一步研究验证。变形菌门是一种在土壤中大量存在的富营养微生物，很多种类的变形菌都可以在土壤中起固氮作用^[24]。本研究发现在同一耕层土壤中轮作玉米的变形菌门种类丰度均高于连作玉米，说明多样化的作物轮作组合有利于土壤固氮类微生物群落的稳定。酸杆菌门在土壤生态系统中有着重要的作用。作为各处理间的第3位优势菌门，在20~40 cm土层中含量较0~20 cm土层更高，且CR处理较CC处理的占比更高，在已明确功能的微生物中，酸杆菌门可降解植物病残体多聚物，参与铁循环，具有光合和反硝化能力，对稳定生态系统发挥着重要作用^[19,25]，抑病土壤中酸杆菌门增多的现象被不同学者所报道^[26]。芽单胞菌门是一种具有解磷、解钾、固氮等生物活性的微生物，有利于提高作物产量^[27]。硝化螺旋菌门中的硝化螺旋菌可将氨氧化成亚硝酸；在硝化作用过程中氨氧化细菌主要负责将氨氧化成反硝化盐，实现亚硝化作用，是硝化过程中非常重要的步骤。氨氧化细菌的存在为作物生长提供了必需的氮素营养，对植物生长代谢和土壤肥力的提高都具有重要的意义^[28]。厚壁菌门细菌在自然环境中分布广泛，其中许多细菌可以在极端环境下生存，如干旱、盐碱环境，常与植物的抗逆性有关^[29]。综上所述，CR处理中变形菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门和厚壁菌门丰度的增加证明了优选的轮作组合为有益细菌的富集提供了良好的微环境。

土壤真菌分为有益真菌（plant growth- promoting fungi，PGPF）和有害真菌，有益真菌有利于增加植物的吸收能力和提高植物的抗性^[30]，因此，增加有益真菌的数量和种类对植物生长有利。但由于受到不同种植作物影响，不同处理中真菌的相对丰度具有一定差异^[31]。本研究发现，CR处理中有益真菌的优势菌门子囊菌门的相对丰度高于CC处理，这与代真林等^[32]的结果相一致。子囊菌门在真菌群落中存在数量最多，大多数为腐生菌，含有纤维素和木质素分解酶，可以将养分有效地分解为易吸收物质。马欣等^[33]在黄土高原的研究表明，农田土壤担子菌门相对丰度显著高于紫花苜蓿土壤，是因为传统耕作措施提高了农田土壤中的木质素含量，从而增加了担子菌门相对丰度。本研究中连作玉米土壤担子菌门总丰度高于轮作玉米，可能是由于连作玉米地块3年的秸秆还田，导致土壤中更多的秸秆得到富集，一定程度上提高了担子菌门的丰度^[34-35]。

连续3年的田间定位试验表明，轮作模式通过提高土地利用效率，实现更高的经济效益。作物多样化种植模式能提高年际间产量稳定性，体现大面积农业生产在应对极端气候方面的显著潜力。不同耕层土壤的微生物群落趋同与变异共存，0~20 cm耕层土壤较20~40 cm土壤微生物群落更加复杂，并形成了不同的细菌群落结构，但对真菌群落的影响较小。与连作玉米相比，3个作物轮作增加了土壤细菌群落的丰度和多样性，在0~40 cm耕层中细菌Chao1指数平均增加22%，但真菌群落的丰度和多样性不受轮作方式的影响，3种作物轮作形成了相对独特的微生物群落结构。此外，轮作还改变了原有的微生物群落组成和分布，提高了有益微生物的数量。