油菜为全国第一大油料作物、第二大冬季作物，常年种植面积700万hm²左右，且尚有400万hm²南方冬闲田和1000万hm²盐碱地具有开发种植油菜的潜力^[1]。菜籽油为国产食用植物油第一大来源，双低菜籽油的饱和脂肪酸含量最低（仅为7%），富含人体必需的ω-6和ω-3脂肪酸，价格亲民^[2]。油菜杂种优势强，增产抗逆效果显著。近10多年来，我国油菜单产大幅提升主要得益于杂交油菜的大面积种植。目前国内杂交油菜授粉控制系统包括细胞质雄性不育、细胞核雄性不育、化学杀雄和自交不亲和等多种类型^[3-4]。其中，细胞核雄性不育生产上应用较多的是双隐性重叠基因控制的品种S45A和2对隐性互作基因控制的品种9012A。9012A由于有临保系，通过临保系和纯合两用系中的不育株杂交可获得全不育群体，从而得到全不育系；再由小面积拔除纯合两用系中的50%可育株，可得到大面积繁种时的全不育系，是非常有应用潜力的授粉控制系统^[5-6]。

目前生产上应用的这些授粉控制系统在杂交制种时均需要将父母本按一定行比分行播种、分开收获或提前割掉父本，在劳动力成本大幅增加以及全程机械化作业的背景下，油菜制种成本高，出错风险大，影响商品杂交种纯度的问题日益凸显。杨光圣等^[7]提出了一种简化的杂交油菜种子生产方法设想，即利用转育了抗苯磺隆类除草剂的自交亲和系为父本，以各种不同类型不育系为母本（包括化学杀雄），在制种过程中父母本混播混收，并通过苗期喷施磺酰脲类除草剂（正常除草浓度）杀死异株，从而提高制种效率，降低杂交种生产成本。

本研究以甘蓝型油菜隐性上位核不育系为母本，自交不亲和系为父本，在制种过程中将父母本按不同比例混播，花期标记母本；成熟后先按父本、母本分开收获，取样后混合，通过基因型检测母本收获种子、父本收获种子以及混收种子的基因型和真杂交种率，探索该制种方式的可行性并确定适合的混播比例。

制种母本为甘蓝型油菜隐性核不育全不育系9012A，由安徽省农业科学院作物研究所选育，该不育系败育彻底，不育性稳定，花蕾和花瓣较小，雌蕊生活力强，异交结实性好^[8]，用该不育系选育了皖油14和核优46等系列杂交种。9012A由纯合两用系不育株和临保系杂交获得，经检测不育株率为97%，符合国家杂交种亲本种子纯度标准。以自交不亲和系s-29为父本，由华中农业大学提供，自交亲和指数为1左右，农艺性状良好。

将母本9012A与父本s-29的种子分别以3种比例方式混合：90%母本+10%父本（9 g母本+1 g父本，T1）、80%母本+20%父本（8 g母本+2 g父本，T2）和75%母本+25%父本（7.5 g母本+2.5 g父本，T3），人工条播，共3个组合，设3次重复，每个小区面积10 m²，常规管理，苗期常规去杂；花期前每个小区套帐隔离，花期调查不育株并系上红绳。成熟期收获时按红绳标记将父本和母本分开收获，并分别取300粒左右种子作为样品，播种后提取叶片DNA，检测父本和母本上收获种子的基因型；取样后将父本和母本收获的种子全部混合，混匀后取混合样300粒左右种子播种，提取幼叶DNA，检测混收种子基因型。

在带有滤纸的培养皿上播种9012A、s-29和F₁代种子，10 d后取幼芽提取DNA并作为PCR扩增模板，利用36对SSR引物扩增并筛选出在双亲和F₁代中有多态性且扩增稳定的引物对，用于后续收获种子的基因型和真杂交种鉴定。

将每个小区母本、父本上收获的种子以及父母本混合种子通过穴盘播种，出苗后按单株取样并提取DNA，用上述筛选出的3对有多态性的SSR引物[SSR37（CGTTCTCACCTCCGATAAGC/TCCGATGTAGAATCAGCAGC）、SSR47（ACGACGATTCAACTCATCTTC/TTAACCAACTTCGCTTTTTG）和SSR126（CATTTCTCAATGATGAATAGTTTTGG/CCATTGATATGGAGATGGGG）]鉴定真、假杂交种。凡是出现双亲杂合带型的记为H，并视为真杂交种；若出现父本带型记为A，母本带型记为B，均视为假杂交种。每个样本检测3次重复，每个重复94个样本，共检测282个单株，统计基因型取平均值，并计算真杂交种率和各种基因型出现频率。

在油菜基因组19条染色体A1-A10和C1-C19上共挑选了36对SSR引物用来筛选亲本间的多态性，共有3对引物能在双亲及F₁代中扩增出不同带型，其中SSR126引物扩增出的带型清晰且稳定，扩增产物大小100 bp左右，因此后续选择这对引物用来鉴定真、假杂交种（图1）。

如表1所示，T1处理的制种产量和真杂交种率最高，小区产量2.13 kg/10 m²，真杂交种率为86.2%；同时父本基因型占比也最低，只有4.2%。T2处理的制种产量为1.85 kg/10 m²，真杂交种率为86.0%，父本基因型为6.4%；T3处理的产量和真杂交种率均最低，产量为1.72 kg/10 m²，真杂交种率为82.0%，父本基因型占比最高，为12.8%。

混收种子中除杂交种基因型H外，父本基因型A和母本基因型B也占有一定比例。出现父本、母本基因型的总体趋势是种子量占比越高，出现该亲本的基因频率越高；同时母本种子占比越高，真杂交种率越高。T1处理中，A、B、H基因型单株数分别为4、9和81，相比其他2个混播组合，真杂交种率最高，父本基因型出现的频率最低；T3处理中，真杂交种率最低，父本基因型出现频率最高；T2处理的各项数值居于两者之间。

对母本收获种子进行基因型分析（表2），发现母本上收获种子除了杂交种基因型H，均还有一定比例的母本基因型B。母本基因型出现频率趋势为母本种子量占比越高，出现母本基因型频率越高，真杂交种率越低。T1处理收获种子中母本基因型出现的频率为10.6%，真杂交种率89.4%；T2处理收获种子中母本基因型出现的频率为8.5%，真杂交种率91.5%；T3处理收获种子中母本基因型出现频率最低，为7.4%，真杂交种率为92.6%。同时，母本种子占比越高，母本上收获的种子量也越多：T1处理母本上收获种子量为1.99 kg/10 m²，T2处理收获1.65 kg/10 m²，T3处理收获1.35 kg/10 m²。

本试验中父本都收获到了少量种子。随着父本种子量占比的提高，父本上收获的种子量也增多（表3），T1、T2和T3这3种混播处理中，父本上收获的种子数量分别是0.14、0.20和0.37 kg/10 m²。

对父本上收获种子进行基因型分析，发现收获种子也有3种基因型，即父本、母本以及杂交种基因型。将父本上收获的每百粒种子中父本种子基因型出现的比例定义为自交结实率。T1处理父本上收获种子真杂交种率最高，为39.4%，自交结实率最低，为53.2%；T3处理父本上收获种子真杂交种率最低，为36.2%，自交结实率最高，为59.6%，母本基因型出现频率最低，T2处理各项数值则居于两者之间。

简单、安全且高效的制种方法不仅有利于优良品种的推广，也有利于种子企业降低生产成本，提高收益率。本试验利用隐性核不育全不育系9012A作母本、自交不亲和系s-29作父本进行混播混收制种，90%母本+10%父本、80%母本+20%父本这2种混播比例杂交种纯度都可以达到商品杂交种标准（杂交种纯度≥85%）。并且由于自交不亲和系自交不能结实的特性，父本花期会延长，有利于给母本授粉从而提高产量。

本研究中的混播混收杂交制种种子中，出现了父本（A）、母本（B）和杂交种（H）3种基因型，理论上杂交制种收获种子均为H基因型。出现A基因型是由于自交不亲和系本身并非100%自交不亲和，有一定的自交结实率，不同自交不亲和系之间自交结实率有差异。出现B基因型是母本全不育系纯度在大田生产条件下难以达到100%，不育系中会混杂有少量纯合两用系可育株和同型临保系，这2种杂株会自交结实，也会把花粉传给不育系，这2种情况都会产生母本基因型。在小面积做好品控的条件下，不育系纯度可以达到100%，但由于本研究是探索大田生产条件下的制种可行性，因此母本全不育系也是选用大田生产下达到国标的种子。

理论上父本收获种子应该均为A基因型，但本试验中父本收获种子也有A、B和H 3种基因型。分析原因，同样是由于全不育系混杂造成：不育系中混杂的杂株表型为可育，收获时被当作父本一起收获，从而出现B基因型；自交不亲和系与杂株花粉也产生了一部分真杂交种，杂株越多，自交结实率就越低。表3中母本种子量越多，父本自交结实率越低，真杂交种的比例增高也验证了这一点。

从本试验可以看出，母本不育系纯度和父本自交结实率对整个制种是否达标非常关键，不育系纯度越高、自交亲和性越低，制种纯度就越高。本试验中母本纯度为97%，父本s-29自交亲和指数为1，混播混收制种纯度最高为86.2%，达到商品杂交种标准。因此，混播制种纯度要达标，制种母本纯度最低要达到国家标准97%，父本自交亲和指数要低于1。这就要求在繁殖全不育系时要做好隔离，及时、彻底拔除50%可育株和自生苗；在选育自交不亲和系时，要选育自交不亲和性稳定，不亲和性程度高，自交结实率低的品系，繁殖时尽量用喷施盐水的方式繁殖，减少混杂环节，也有助于提高杂交种纯度。

长久以来，自交不亲和系在杂种优势利用中一直被用作母本，也选育了一些杂交油菜品种如渝华1号^[9]等。本研究中则是利用自交不亲和系不能自交结实的特性，将其用作父本，以实现制种方法的突破。该制种方法的优点是操作简单，可以实现全程机械化且产量高；缺点是该方法中父本为自交不亲和系，在一定程度上限制了配组的灵活性。在实际操作中，可以在选配到优异组合之后，利用分子标记辅助选择将其父本转育成自交不亲和系，这样在制种时就可以大大简化制种程序，降低生产成本。

利用油菜隐性核不育系9012A和自交不亲和系s-29混播混收制种，制种纯度可以达到商品种子纯度要求，且以90%母本和10%父本种子混播制种的产量和纯度最高，为最佳混播比例。