掌叶半夏（Pinellia pedatisecta）为天南星科半夏属多年生草本植物,以块茎入药,主要含有氨基酸、甙类、生物碱、二肽类等成分,有明显的镇静、抗惊厥作用,对心血管病、宫颈癌等疾病具有一定的疗效[1,2]。掌叶半夏在我国河北、山东、河南、江苏、陕西等地均有大面积种植[3,4]。近些年,随着中药材需求量的增大和价格的上升,河北安国地区掌叶半夏的种植面积不断扩大,而连年种植导致掌叶半夏生产中病害频发,且病害种类越来越多,主要包括病毒病（花叶病）、根腐病（茎块腐烂病）、茎基腐病、烫叶病、茎枯病、黄萎病、枯萎病、炭疽病等[5]。目前对这些病害病原菌的研究较少,且大多不够深入,很多病害的具体病原未知。前期调查表明,安国地区掌叶半夏一年生幼苗和二年生植株的茎基腐病病害发生普遍、病情发展迅速、造成的损失严重,一般地块死苗率达10%~30%,严重时达60%~80%,甚至绝收,严重影响了当地掌叶半夏的生产。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 掌叶半夏茎基腐病病株 于2016年在河北省安国市掌叶半夏种植区,采选茎基腐病发病典型植株为供试材料。
1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂粉16g,蒸馏水定容至1L。
玉米粉琼脂培养基（CMA）：玉米粉300g,琼脂粉16g,蒸馏水定容至1L。
1.1.3 供试药剂 3%甲霜·恶霉灵AS、50%烯酰吗啉WP、40%氟硅唑EC、99%恶霉灵TC和35%精甲霜灵ES,3种生物类药剂1×106孢子/g寡雄腐霉菌WP、1×1011芽孢/g枯草芽孢杆菌WP和玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素粗提物（由河北农业大学植物保护学院植物病害生物防治与分子植物病理学实验室提供）。
1.2 病原菌的分离与纯化
将采集的病株用常规组织分离法[10]分离病原菌,在超净工作台中,取发病植株的茎基部,用解剖刀从病健交界处切取数块病组织（5mm×5mm）,将切取好的组织放入75%酒精中消毒30s,然后转移到0.1%的升汞溶液中浸渍1min,用无菌水冲洗3次,灭菌吸水纸吸干表面水分后转移到CMA培养基上,然后置于28℃生化培养箱中培养3~4d。待长出菌落后,挑取菌落边缘菌丝转接到新的CMA培养基上纯化培养,对于产生孢子的菌落采用琼胶平板表面单孢子挑取法于超净工作台挑取单个孢子或孢子囊。
1.3 病原菌孢子悬浮液的制备
将瓜果腐霉在CMA培养基上28℃避光培养23d,在显微镜下观察到游动孢子后,向培养皿中加入无菌水,用灭菌玻璃棒刮下菌丝,用4层纱布过滤收集孢子悬浮液。
1.4 病原菌致病性测定
选取掌叶半夏的健康块茎,先用清水清洗干净,放入75%的酒精中浸泡10min进行表面消毒,然后用无菌水冲洗3~5次,阴干后种植到装有灭菌土壤的花盆中,每盆放1~2个消毒块茎。待植株出土,长出至少两片展开真叶后,拨开土层,将植株轻轻拔出,冲洗干净根部和茎基部,用灭菌牙签刺伤茎基部,于浓度为1.4×105孢子/mL的孢子悬浮液中浸泡10min后,移植到原盆中,对照植株采用等量的无菌水浸泡10min后,移植回原盆中,每个处理5次重复。接菌后每天对试验组和对照组植株进行观察,拍照并记录。对发病植株再次进行病原菌的分离、纯化与鉴定,并与原分离病原菌进行比较。
1.5 病原菌的鉴定
1.5.1 形态学鉴定 将分离纯化后的菌株接种在CMA培养基上,于28℃生化培养箱中培养23d后,在显微镜下观察病原菌菌丝、孢子囊、藏卵器、雄器及卵孢子等形态特征。
1.5.2 分子生物学鉴定 采用Chelex-100法提取病原菌DNA[11]。采用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对病原菌进行PCR扩增。扩增体系为25μL：其中DNA模板3μL,10×Buffer 2.5μL,10mmol/L dNTP 0.5μL,2.5U/μL Taq酶0.2μL,10μmol/L引物ITS1/ITS4各0.5μL,dd H2O补足25μL。反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸40s,30个循环;72℃延伸8min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后送往生工生物（上海）股份有限公司测序。获得的序列经BLAST与NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已知序列进行同源性比较,用MEGA 6.06软件中Neighbor-joining分析法构建系统发育树,并通过Bootstraps进行1 000次渐启式复制以检验进化树中树枝上数据的置信度。
1.6 病原菌的室内毒力测定
采用菌丝生长速率法,测定8种供试药剂对病原菌的毒力,配制不同浓度梯度的含药PDA平板,各药剂浓度见表1。用打孔器从培养1d的病原菌菌落边缘打取菌饼,每个制备好的PDA平板中央接种一个菌饼,之后放到27℃的生化培养箱中培养。待对照组的菌落直径达平板的2/3以上（约1d）时,用十字交叉法测量菌落直径,计算抑制率：
抑制率（%）=[对照菌落直径（mm）-处理菌落直径（mm）]/对照菌落直径（mm）×100
将抑制率转换成几率值,作为坐标轴的纵坐标,即因变量（Y）;以各处理药剂浓度的对数值为横坐标,即自变量（X）,以最小二乘法计算回归方程,得出毒力回归方程Y=aX+b,计算供试药剂对病原菌的抑制中浓度（median effective concentration,EC50）和回归方程决定系数R2。
表1 供试药剂浓度设置
Table 1
| 供试药剂Test fungicide | 浓度梯度Concentration set (mg/L) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 3%甲霜·恶霉灵AS 3% metalaxyl·hymexazol AS | 25 | 50 | 100 | 200 | 500 |
| 50%烯酰吗啉WP 50% dimethomorph WP | 10 | 20 | 50 | 200 | 500 |
| 40%氟硅唑EC 40% flusilazole EC | 10 | 20 | 40 | 80 | 160 |
| 99%恶霉灵TC 99% hymexazol TC | 25 | 50 | 100 | 200 | 400 |
| 35%精甲霜灵ES 35% metalaxyl-M ES | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | 20 |
| 1×106孢子/g寡雄腐霉菌WP 1×106 spores per gram Py. oligandrum WP | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 50 |
| 1×1011芽孢/g枯草芽孢杆菌WP 1×1011 spores per gramBacillus subtilis WP | 0.2 | 1 | 5 | 25 | 125 |
| 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素粗提物 Crude antibiotic extracts of S. roseoflavus Men-myco-93-63 | 12.5 | 25 | 50 | 100 | 200 |
2 结果与分析
2.1 掌叶半夏茎基腐病田间症状
掌叶半夏茎基腐病主要为害植株茎基部,造成芽腐（封底图Ⅰ-a）、茎基部腐烂（封底图Ⅰ-b）。地上部叶片皱缩（封底图Ⅰ-c）,病斑水渍状,病势发展迅速,有时症状尚未明显表现即突然死亡,湿度大时,靠近地面的茎基部出现白色棉絮状的菌丝体（封底图Ⅰ-d）。
2.2 病原菌的致病性测定
对掌叶半夏茎基腐病病原菌进行分离,获得N1、N2、N3和N4分离菌株,将这4个菌株接种到健康的掌叶半夏植株上。结果显示,N1、N2和N3都不表现发病症状,植株正常生长。N4接种2d后出现叶片皱缩症状,3d后茎基部腐烂,幼苗猝倒,其发病特点和症状与掌叶半夏茎基腐病一致,从发病部位重新分离病原物,经显微观察发现,与原接种物N4的菌落、菌丝、孢子囊形态等特征完全一致（封底图Ⅱ）。
2.3 掌叶半夏茎基腐病的病原菌鉴定
2.3.1 形态学鉴定 分离纯化并经柯赫氏法则验证致病性后的菌株N4在CMA上呈放射状生长,白色,菌丝发达,宽2.4~8.3μm;孢子囊为膨大的菌丝或呈瓣形,顶生或间生,大小平均为 14.2μm×213.6μm。在CMA上培养23d后陆续出现卵孢子、藏卵器和雄器,数量随时间的延长而增加;藏卵器多球形,壁平滑,多顶生,直径平均为20.5μm;雄器袋状,顶生或间生,直径平均为10.1μm×11.3μm;卵孢子球形,壁平滑,不满器,直径平均为19.8μm（封底图Ⅲ）。根据中国真菌志[14]中霜霉目菌物的孢子囊、卵孢子、藏卵器和雄器等的形态特征,将安国掌叶半夏茎基腐病原菌鉴定为瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）。
2.3.2 rDNA-ITS序列分析 提取病原菌的基因组DNA,经引物ITS1/ITS4扩增,测序后得到838bp的扩增条带。采用BLAST进行同源性比对,结果显示与Py. aphanidermatum相似度高达99%,构建系统发育树（图1）,显示该菌株与Py. aphanidermatum（KU210123.1）在自举值100%水平相聚一簇。由病原菌的形态特征和分子检测结果,可确定该病原菌为瓜果腐霉。
图1
图1
基于rDNA-ITS序列构建的N4的系统发育树
Fig.1
Phylogenetic tree of N4 based on rDNA-ITS sequences
2.4 防治药剂的筛选
8种防治药剂的室内毒力测定结果显示,35%精甲霜灵ES对菌丝生长的抑制活性最高,EC50为12.81μg/mL;玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素粗提物、40%氟硅唑EC和99%恶霉灵TC对菌丝生长也具有较好的抑制效果,EC50分别为41.74、54.16和56.90μg/mL;而1×1011芽孢/g枯草芽孢杆菌WP、1×106孢子/g寡雄腐霉菌WP、3%甲霜·恶霉灵AS和50%烯酰吗啉WP对菌丝生长的抑制作用较差,EC50均高于300μg/mL（表2）。
表2 供试药剂对瓜果腐霉的室内毒力测定
Table 2
| 编号 No. | 供试药剂Test fungicide | 毒力回归方程 Virulence regression equation | R2 | EC50(μg/mL) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 35%精甲霜灵ES 35% metalaxyl-M ES | Y=1.00X+3.89 | 0.974 | 12.81 |
| 2 | 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素粗提物 Crude antibiotic extracts of S. roseoflavus Men-myco-93-63 | Y=1.55X+2.49 | 0.988 | 41.74 |
| 3 | 40%氟硅唑EC 40% flusilazole EC | Y=1.70X+2.05 | 0.992 | 54.16 |
| 4 | 99%恶霉灵TC 99% hymexazol TC | Y=1.59X+2.20 | 0.990 | 56.90 |
| 5 | 1×1011芽孢/g枯草芽孢杆菌WP 1×1011spores per gram B. subtilis WP | Y=0.49X+3.76 | 0.929 | 359.80 |
| 6 | 1×106孢子/g寡雄腐霉菌WP 1×106 spores per gram Py. oligandrum WP | Y=0.54X+3.59 | 0.976 | 414.50 |
| 7 | 3%甲霜·恶霉灵AS 3% metalaxyl·hymexazol AS | Y=0.83X+2.56 | 0.981 | 864.00 |
| 8 | 50%烯酰吗啉WP 50% dimethomorph WP | Y=1.13X+1.28 | 0.970 | 1 940.00 |
3 讨论
与镰刀菌（Fusarium spp.）和丝核菌（Rhizoctonia spp.）等茎腐病常见病原真菌相比,由腐霉（Pythium spp.）和疫霉（Phytophthora spp.）引起的植物病害病情发展迅速,难以控制,并且防治药剂多种多样,生产中若盲目用药,或错过最佳施药时期,会给种植者带来严重的经济损失。因此,明确致病病原至关重要。本研究根据安国田间掌叶半夏茎基腐病害发生情况,采集典型病株进行病原菌的分离,通过形态、分子鉴定和柯赫氏法则的验证,最终确定安国地区掌叶半夏茎基腐病病原菌为瓜果腐霉。
腐霉种类多且形态多样,特别是有些腐霉的鉴别特征不容易形成,所以在形态观察的基础上,需要结合分子生物学技术进行鉴定。rDNA-ITS序列分析已用于探讨部分腐霉种的系统发育与其形态特征[15],商靖等[16]选用通用引物ITS1和ITS4从核桃基腐病的病原中鉴定出了寡雄腐霉;周晓云等[17]选用ITS1和ITS4引物从红掌根腐病病原中鉴定出了华丽腐霉;柴兆祥等[18]用通用引物ITS1和ITS4鉴定出了硬腐霉;Lévesque等[19]发明了利用反向斑点杂交技术来鉴定未知腐霉属的种群;Utkhede等[20]用反向斑点杂交技术鉴定出了造成营养水培生菜的根腐病病原为瓜果腐霉。本研究选用通用引物ITS1和ITS4对病原菌进行鉴定,最终确定掌叶半夏茎基腐病的病原菌为瓜果腐霉。
中药材的病害防治对药剂的安全性要求高,对防治药剂进行合理筛选,是中药材病害防治中非常重要的工作。本研究选取的生物农药枯草芽孢杆菌和寡雄腐霉两种生物制剂对病原菌的抑制效果并不明显,因此化学防治依然是目前掌叶半夏茎基腐病防治的主要方式。本研究选取的供试化学药剂均为常见的对腐霉病害有效的药剂,在其他作物上安全性高,另外,河北农业大学植物病害防治课题组前期试验发现,烯酰吗啉、精甲霜灵、代森锰锌、恶霉灵等化学药剂对掌叶半夏疫病田间防治效果明显,并且未发现对人畜的安全性问题[23],因此,可作为掌叶半夏茎基腐病防治的推荐药剂,但这些药剂农药残留问题还需进一步研究。
4 结论
通过形态鉴定和rDNA-ITS序列分析,安国掌叶半夏茎基腐病的病原鉴定为瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）。35%精甲霜灵ES、玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素粗提物、40%氟硅唑EC、99%恶霉灵TC对瓜果腐霉菌丝的生长具有较明显的抑制作用,EC50分别为12.81、41.74、54.16和56.90μg/mL;而1×1011芽孢/g枯草芽孢杆菌WP、1×106孢子/g寡雄腐霉菌WP、3%甲霜·恶霉灵AS和50%烯酰吗啉WP对病菌的抑制效果不明显。
参考文献
一种快速高效提取病原真菌DNA作为PCR模板的方法
真菌rDNA-ITS序列分析适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析。真菌DNA的提取采用传统的方法，步骤繁琐，需要较长时间。采用Chelex-100法提取真菌DNA，使用PCR扩增rDNA-ITS序列评价提取核酸的质量。结果显示，该方法具有经济、简便、快速、高效的特点，是一种比较理想的提取真菌基因组DNA作为PCR模板的方法。
核桃基腐病的病原鉴定
DOI:10.11707/j.1001-7488.20101216
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从新疆阿克苏地区核桃园发病的核桃树上采集的病样经分离、纯化得到2种菌。经田间人工接种致病性测定,明确了引起核桃基腐病的病原菌。根据形态特征和培养特性初步鉴定核桃基腐病的病原菌为寡雄腐霉。采用真菌通用引物对分离的病原菌进行PCR扩增,核糖体DNA内转录间隔区测序,并将测序结果在GenBank中进行同源性比对分析,分子鉴定与形态鉴定结果一致。寡雄腐霉作为核桃基腐病病原菌系首次报道。
玉米根围土壤中腐霉菌的分离鉴定及核糖体DNA-ITS序列分析
DOI:10.11686/cyxb20090317
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[本文引用: 1]
从兰州地区的红古、七里河等地采集玉米根围土壤标样，诱饵法与组织分离法相结合分离纯化到２３株腐霉菌株，通过形态特征、培养特性、生长速度和对温度适应范围的研究，结合ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析，将分离到的腐霉菌株鉴定为硬腐霉、终极腐霉和一个腐霉待定种。这是首次报道在我国分离到硬腐霉，为我国新记录种；终极腐霉也系首次在甘肃从玉米根围土壤中分离到。统计表明，３种腐霉菌种在兰州地区玉米根围土壤中的分离频率不同，终极腐霉出现次数最多，为优势种群，分离频率为６０．９％；其次为腐霉待定种，分离频率为２６．１％；而硬腐霉分离频率最低，为１３．０％。
Identification of some oomycetes by reverse dot blot hybridization
DOI:10.1094/PHYTO.1998.88.3.213
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PMID:19700851
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To explore the molecular mechanisms involved in asexual spore development in Phytophthora sojae, the zoospores of strain PS26 were treated with ultraviolet (UV) irradiation. After selection, a mutant progeny, termed PS26-U03, was obtained and demonstrated to exhibit no oospore production. A suppression subtractive hybridization (SSH) approach was developed to investigate differences in gene expression between PS26 and PS26-U03 during asexual sporogenesis. Of the 126 sequences chosen for examination, 39 putative unigenes were identified that exhibit high expression in PS26. These sequences are predicted to encode proteins involved in metabolism, cell cycle, protein biosynthesis, cell signalling, cell defence, and transcription regulation. Seven clones were selected for temporal expression analysis using RT-PCR based on the results of the dot-blot screens. Three of the selected genes, developmental protein DG1037 (UB88), glycoside hydrolase (UB149) and a hypothetical protein (UB145), were expressed only in PS26, whereas the transcripts of phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase (UB36), FAD-dependent pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase (UB226) and sugar transporter (UB256) were expressed at very low levels in PS26-U03 but at high levels in PS26.
Pythium aphanidermatum root rot in hydroponically grown lettuce and the effect of chemical and biological agents on its control
DOI:10.1080/07060660009500487 URL [本文引用: 1]
上海地区一品红根腐病病原菌和药剂筛选研究
于2001～2002年对上海地区一品红根腐病病原菌的种类鉴别和防治该病的药剂筛选作了研究.试验证明在上海浦东新区发生的一品红根腐病菌为瓜果腐霉[Pythium aphanidermatum (Eds.)Fitzp.];经两年田间药剂筛选试验,得出对一品红根腐病有理想防效的药剂及其使用浓度为97%恶霉灵(Hymexazol)WP2500～3000倍液和25%瑞毒霉(Metalaxyl)WP600～800倍液.
