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作物杂志, 2020, 36(4): 79-83 doi: 10.16035/j.issn.1001-7283.2020.04.011

遗传育种·种质资源·生物技术

普通豇豆应用核心种质的SSR指纹图谱构建及多样性分析

公丹,1,2, 王素华1, 程须珍,1, 王丽侠,1

1中国农业科学院作物科学研究所,100081,北京

2长江大学农学院,434020,湖北荆州

Construction of SSR Fingerprints and Diversity Analysis of a Cowpea Applied Core Collection

Gong Dan,1,2, Wang Suhua1, Cheng Xuzhen,1, Wang Lixia,1

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

2College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434020, Hubei, China

通讯作者: 王丽侠,研究方向为食用豆种质资源收集保存、创新利用及新基因发掘,E-mail： wanglixia03@caas.cn; 程须珍,研究方向为食用豆类品种资源及优异种质创制和遗传育种,E-mail： chengxuzhen@caas.cn

收稿日期: 2019-12-2   修回日期: 2020-06-5   网络出版日期: 2020-07-17

基金资助: 国家食用豆产业技术体系(CARS-08)

Received: 2019-12-2   Revised: 2020-06-5   Online: 2020-07-17

作者简介 About authors

公丹,研究方向为食用豆抗病基因的挖掘与鉴定,E-mail： gongdan1992@sina.com

摘要

不同种质资源群体的多样性及遗传背景分析可为种质资源收集保存及创新利用提供有效信息。对不同来源的88份普通豇豆应用核心种质资源进行了14个SSR位点的指纹图谱构建及多样性分析,共检测到39个等位变异,每对引物检测到2~5个,平均为2.79。多态信息含量（PIC）变幅为0.25~0.72,平均为0.58。UPGMA聚类结果显示,除了3对种质外,39个等位变异可将其他材料有效区分,且在遗传相似系数为0.63时,88份种质可分为4个类群,地理来源相同的材料有聚在一起的趋势。

关键词： 豇豆 ; 种质资源 ; SSR ; 遗传多样性 ; 聚类分析

Abstract

Assessment of the diversity and genetic background of different germplasm resources can provide useful information for further collection, preservation and utilization. We evaluated 88 cowpea core germplasm resources from different sources using 14 SSR markers. The total of 39 alleles were detected and two to five alleles per locus were detected for each pair of primers with an average of 2.79. The polymorphic information content (PIC) varied from 0.25 to 0.72, and averaged at 0.58. The UPGMA (unweight pair group method with arithmetic mean) result showed that all the reserved collections could be distinguished by 39 alleles except 3 couples of germplasms. The 88 collections were divided into four groups at the genetic similarity of 0.63, and the collections from the same origins tended to be clustered together.

Keywords： Cowpea ; Germplasm resources ; SSR ; Genetic diversity ; Clustering analysis

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本文引用格式

公丹, 王素华, 程须珍, 王丽侠. 普通豇豆应用核心种质的SSR指纹图谱构建及多样性分析[J]. 作物杂志, 2020, 36(4): 79-83 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2020.04.011

Gong Dan, Wang Suhua, Cheng Xuzhen, Wang Lixia. Construction of SSR Fingerprints and Diversity Analysis of a Cowpea Applied Core Collection[J]. Crops, 2020, 36(4): 79-83 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2020.04.011

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

普通豇豆（Vigna unguiculata）属于豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papilionoideae）菜豆族（Phaseoleae）豇豆属（Vigna）[1],是世界上主要的食用豆类作物之一。普通豇豆广泛种植于非洲、拉丁美洲等贫困及生态贫瘠地区[2,3],因其富含人体所需的植物性蛋白及膳食纤维,在人们的日常饮食和营养保健中发挥着重要作用,也是亚洲、非洲和拉丁美洲等地区人们植物蛋白质的重要来源。普通豇豆具有高效的固氮能力,可提高土壤肥力,常用于禾谷类作物的轮作或间作套种等[3,4],在我国栽培历史悠久,全国各地均有种植。我国共收集豇豆种质资源4 700多份[5],但由于育种研究相对落后,主栽品种多为地方品种,资源利用率较低。

遗传多样性分析可揭示不同来源种质资源的遗传背景差异和变异水平,为种质资源的再收集及育种利用等提供参考依据。常用于多样性分析的手段有形态学[6]、等位酶[7]和DNA分子标记[8]等。简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）分子标记不受环境影响,具有操作简单、共显性、可重复性和多态性丰富等特点,在遗传多样性分析中应用广泛[9,10,11,12]。

SSR标记在普通豇豆中的研究相对较少。Li等[13]利用SSR标记分析了90份来自国际干旱农业研究所（The International Institute of Tropical Agriculture,IITA）的普通豇豆品系的遗传背景。徐雁鸿等[14]分析了316份不同来源的豇豆种质资源的遗传多样性,并指出国内外资源的遗传背景差异显著。本研究在表型评鉴的基础上,以筛选的88份普通豇豆应用核心种质为材料,用14对SSR引物构建分子指纹图谱,分析不同来源资源的多样性及遗传背景差异,为下一步资源收集提供参考,也为这些核心种质的进一步利用提供标记辅助选择信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料

88份普通豇豆应用核心种质中78份来自国内各省（市、区）,9份来自国际干旱农业研究所,1份来源未知,这些种质的种子均由中国农业科学院作物科学研究所提供（表1）。

表1   88份普通豇豆核心种质资源信息

Table 1  Information of 88 cowpea core germplasm resources

序号
Number		统一编号
Uniform number		品种
Variety		原产地
Origin		序号
Number		统一编号
Uniform number		品种
Variety		原产地
Origin
BJ-1I00003白黑眼中国北京JL-3-JD6中国吉林
BJ-2I00030红豇豆中国北京JL-4-黑豇豆9801中国吉林
BJ-3I01338中豇1号中国北京HL-1I00344花豇豆中国黑龙江
BJ-4I01343豇豆中国北京HL-2I02828豇豆中国黑龙江
BJ-5I01921豇豆中国北京TJ-1I00502豇豆中国天津
BJ-6I01922豇豆中国北京TJ-2I00503豇豆中国天津
BJ-7I01925豇豆中国北京SHI00511豇豆中国上海
BJ-8I01927豇豆中国北京AH-1I00764白豇豆中国安徽
BJ-9I02620豇豆中国北京AH-2I00769白豇豆中国安徽
BJ-10I02631夏宝中国北京AH-3I00774白豇豆中国安徽
BJ-11I02632春燕中国北京HB-1I00970黑饭豆中国湖北
BJ-12I03099豇豆中国北京HB-2I02740坡豇豆中国湖北
BJ-13I03112豇豆中国北京GX-1I01117红饭豆中国广西
BJ-14I03113豇豆中国北京GX-2I01187狗面豆中国广西
BJ-15I03114豇豆中国北京SN-1I01230打豇豆中国陕西
BJ-16I03118豇豆中国北京SN-2-JD4中国陕西
BJ-17I03120豇豆中国北京SN-3-JD5中国陕西
BJ-18I03126豇豆中国北京IITA-1I01273IT82D-703IITA
BJ-19I03132豇豆中国北京IITA-2I01274IT82D-716IITA
BJ-20I03133豇豆中国北京IITA-3I01278IT82D-952IITA
BJ-21I03137豇豆中国北京IITA-4I01281TVX3236IITA
BJ-22I03138豇豆中国北京IITA-5I01293中豇2号(IT82D-789)IITA
BJ-23I03139豇豆中国北京IITA-6I01298IT84E-124IITA
BJ-24I03140豇豆中国北京IITA-7I01299IT82D-453-2IITA
BJ-25I03141豇豆中国北京IITA-8I01302IT83S-852IITA
BJ-26I03171豇豆中国北京IITA-9I01321IT82D-889IITA
BJ-27I03181豇豆中国北京HA-1I01398白豇豆中国河南
BJ-28I03182豇豆中国北京HA-2I01407白豇豆中国河南
BJ-29I03282豇豆中国北京HA-3I02818豫豇1号中国河南
HE-1I00058豇豆中国河北NX-1I01831豇豆中国宁夏
HE-2I00081串蔓花豇豆中国河北NX-2I01836豇豆中国宁夏
HE-3I00563花豇豆中国河北SDI02372胡豇豆中国山东
HE-4-JD1中国河北HN-1I02496豇豆中国湖南
SX-1I00093爬豇豆中国山西HN-2I02497豇豆中国湖南
SX-2-JD3中国山西HN-3I02504枫树饭豆中国湖南
IM-1I00199红豇豆中国内蒙古HN-4I02510豇豆中国湖南
IM-2I00200豇豆中国内蒙古HN-5I03101早生王中国湖南
IM-3I02130长豇豆中国内蒙古HN-6I03102耐热王中国湖南
IM-4-JD9中国内蒙古GD-1I03144长豆角中国广东
LN-1I00258豇豆中国辽宁GD-2I03145早豆角中国广东
LN-2I00272花豇豆中国辽宁JS-2-苏豇2号中国江苏
LN-3I00277花豇豆中国辽宁JS-2-早豇1号中国江苏
JL-1I00321花豇豆中国吉林JS-3-海门短肉豇中国江苏
JL-2I00336大花豇豆中国吉林UnknowI01314-不明

Note: IITA represent The International Institute of Tropical Agriculture

注：IITA指国际干旱农业研究所

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1.2 基因组DNA的提取

每份材料选取2~3粒健壮种子播于营养钵内,采集三出复叶的幼嫩叶片,用改良的CTAB法[15]提取基因组DNA,用紫外分光光度计测定其浓度,用ddH2O稀释至20ng/μL,于4℃冰箱保存备用。

1.3 PCR扩增反应

14对SSR多态性引物序列分别来自普通豇豆[13]和普通菜豆[16]。所有引物均由北京赛百盛基因技术有限公司合成。PCR扩增反应在LomgGeneA200热循环仪上进行,反应体系10μL,包括20ng/μL DNA模板1μL,上、下游引物（2μmol/μL）各0.5μL,5μL Mix（包含Mg2+、Taq酶和dNTPs）,其余用ddH2O补齐。PCR反应程序：95℃预变性5min;94℃变性30s,退火30s,72℃延伸30s,循环35次;72℃延伸5min。

1.4 凝胶电泳检测

PCR 反应结束后,用8%的聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳分离扩增产物,200V恒压下电泳。凝胶用蒸馏水洗涤2次后,用0.2% AgNO3溶液染色10min,1.5% NaOH加0.5%甲醛溶液显影至条带清晰,用蒸馏水洗涤2次。

1.5 数据统计与分析

根据PCR扩增片段即等位变异迁移率的不同,对电泳图谱上清晰的DNA条带进行统计,样品间同一迁移位置上的电泳条带记为“1”,无则记为“0”。SSR标记多态性指标以多态性息含量（polymorphism information content,PIC）表示,PICk=1-∑(Pi)2,式中Pi表示第k个位点上第i个等位基因的频率。利用NTSYSpc 2.1计算材料间遗传相似系数,用非加权平均法（unweight pair group method with arithmetic mean,UPGMA）进行遗传相似性聚类分析,并绘制材料间亲缘关系聚类树状图。利用Microsoft Excel进行其他统计分析。

2 结果与分析

2.1 SSR标记的多态性分析

由表2可知,14对SSR引物在88份普通豇豆材料中共检测到39个等位变异,每对引物的等位变异数为2~5个,平均每对2.79个,其中引物AG1检测到的等位变异最多,其次是引物VM31和12M1。PIC值变化范围为0.25~0.72,平均为0.58。除引物VM30、VM36和VM34外,其他引物的PIC值均大于等于0.50。简单相关性分析显示,等位变异数与PIC值无显著相关。

表2   基于14个SSR分子标记的88份普通豇豆应用核心种质多态性信息

Table 2  Polymorphic information of 88 cowpea core germplasm based on 14 SSR loci

引物编号
Primer
number		等位基因数
Number
of alleles		有效等位基因数
Number of
effective alleles		多态性信息含量
Polymorphism
information content
VM3031.340.25
VM3631.950.49
VM3142.950.66
VM3523.400.71
VM3421.730.42
VM3932.910.66
VM2822.970.66
PVBR18532.980.66
BMd-222.250.56
BMd-1722.290.56
AG152.080.52
PVBR423.620.72
PVBR1223.250.69
12M142.010.50
平均
Average		2.792.550.58

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2.2 聚类分析

UPGMA结果显示,除AH-1与AH-3、BJ-4与IM-4新品系、及BJ-11与HN-4 3对种质外,其余种质均能被有效区分（图1）。

图1

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图1   88份普通豇豆应用核心种质的树状聚类图

Fig.1   Cluster tree of 88 cowpea core germplasm


按照遗传相似系数,可将88份普通豇豆应用核心种质分为4个类群。其中第一类群含46份种质,包括来自中国江苏、安徽、山东、湖南和广东的所有种质,及来自中国北京、吉林、辽宁和内蒙古等的部分种质;第二类群包括18份种质,主要来自中国北京（8份）和IITA（7份）,另外3份分别来自中国湖北、河北和辽宁;第三类群包括17份种质,除中国广西、湖北和IITA各1份外,其余均来自我国北方各地的种质;第四类群仅包括7份种质,来自中国北京、河南、黑龙江、上海和天津,其中来自中国天津种质TJ-2的遗传背景与其他种质差异最大。从聚类图（图1）可以看出,大部分来源一致的种质有聚在一起的趋势。

3 讨论

SSR分子标记因其共显性、可重复性、精确性和多态性丰富等特点,已被广泛应用于动植物种内[17]、种间[18]的多样性及品种特征鉴定[19]等分析中。普通豇豆是我国主要的栽培豆种之一,保存有3 000多份种质资源,但其育种及基础研究相对薄弱,资源利用率低。因此,开展普通豇豆种质资源的SSR分析,将有效提高种质资源在遗传研究和育种利用中的效率。国内外豇豆种质资源均有丰富的表型变异类型[20,21],然而本研究中平均SSR等位变异数仅为2.79个,甚至有3对种质不能被有效区分开,远低于长豇豆[2]和大豆[22]等豆科作物,但与徐雁鸿等[14]对316份国内外普通豇豆及其近缘作物绿豆[23]和小豆[24]等的研究结果相对一致。豇豆属作物较低的SSR变异水平不利于图谱构建及基因定位[25,26]。随着普通豇豆全基因组序列的释放[27],DNA分子标记开发更加便利,而SSR作为操作简单、基因组分布广泛的DNA分子标记之一,在多样性分析及图谱构建中具有独特优势。不同SSR位点的变异水平差异较大[28],因此,有必要进一步开发并筛选多态性高的SSR标记,以满足遗传连锁图谱的加密及基因定位等研究需要。

研究表明,不同地理来源的资源群体间遗传背景具有一定的差异[17,22,29]。普通豇豆的遗传多样性也显示,不仅国内外资源的遗传背景明显不同,国内不同地理生态区的资源也有一定的遗传背景差异[14]。虽然本研究中所用核心样本分布比较广泛,因种质数及SSR位点均相对较少,很难准确反映各种质整体遗传背景的差异,但由聚类结果还是可以看出这一趋势,如中国安徽的3份种质间遗传距离较近,而中国湖南的6份种质也聚在同一大类群,因此在杂交育种时需尽量选取来源不同的资源进行组配,以拓宽遗传背景。聚类分析结果表明,IITA的种质普遍游离于中国种质外,说明加强种质的引进,有助于提高我国普通豇豆种质资源的遗传多样性。

本研究构建了88份核心豇豆种质资源的SSR指纹图谱,为这些种质的杂交组配及标记辅助选择提供可靠信息,遗传多样性分析结果可作为资源考察、收集和引进等的参考。本研究发现有3对种质在14个SSR位点的指纹一致,而且大部分SSR标记对种质的区分能力有限。因此,需要加强多态性高的SSR引物的筛选,建立一套更有效的核心SSR标记,提高标记辅助选择的效率。

4 结论

除3对种质外,其余85份普通豇豆种质均可以被14对SSR引物有效区分,且聚类结果显示来源相同的种质大多聚在一起,但是14对SSR引物的平均等位变异数相对较低。不同SSR位点的变异水平差异较大,需进一步开发并筛选多态性高的SSR标记来满足基因遗传定位研究等要求。

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