雪茄烟是一种特殊的烟草制品,由雪茄烟叶直接卷制而成,具有味苦透甘、香气醇厚和满足感强等特点。目前国产雪茄烟所用原料大部分依赖进口,国内雪茄烟原料生产起步较晚,整体质量偏低。四川省是我国传统晾晒烟产区,其生态条件适宜雪茄烟生长,但栽培调制技术尚未形成规范,仍存在施氮量过高、种植密度过大和起垄方式不规范等问题,种植的雪茄烟烟叶质量无法满足国内雪茄烟工业生产需求^[1]。

不同种植密度对烟田光、温、水和土等因素有重要影响,有研究表明,这些因素也会影响植物体内抗氧化酶活性^[2,3]。四川地区降雨量较大,土壤通透性较差,不利于雪茄烟伸根期根系的生长发育,容易造成烟叶后期抗逆性较差^[4]。种植密度过低时无法保证烟叶产量,过高时则影响烟叶发育,降低烟叶质量^[5]。烟叶进入成熟期后,中上部烟叶在高温高光等不良因素胁迫下易发生早衰和假熟等现象,烟叶膜脂过氧化程度加大,使烟叶出现粗筋和厚叶等现象,严重影响烟叶品质^[6,7,8]。研究表明,影响植物体内抗氧化酶活性的因素主要为温度、水分、光照强度、氮素分布以及烟叶自身成熟度等。谷萌萌等^[9]研究表明,烟叶生长前期降雨量和成熟期高温与烟叶“高温逼熟”发生率有正相关关系;卢素萍等^[10]研究表明,不同光质对烟叶膜脂过氧化程度有重要的影响;王志恒等^[11]研究表明,高温对植物膜脂过氧化特性有显著的影响。

目前关于烟草膜脂过氧化特性的研究主要围绕在烤烟方面,雪茄烟作为一种新型烟草,与传统烤烟有所不同,其叶片较薄,留叶数较少,成熟周期较短。国内现有研究大多是对烟叶化学成分等调制后指标进行分析,极少关注不同种植密度对烟叶膜脂过氧化特性的影响,而从近些年四川雪茄烟生产实际中发现,四川省目前的种植密度可能过高,影响了四川省雪茄烟的烟叶质量。本试验通过探究不同种植密度下雪茄烟烟叶抗氧化能力的强弱及不同环境因素对烟叶膜脂过氧化程度的影响,结合其化学成分、感官质量和经济性状的差异,确定适宜四川省雪茄烟的种植密度,为提高四川省雪茄烟烟叶产量和质量及工业可用性提供理论依据。

试验于2019年4-9月在四川省德阳市什邡市师古镇洛阳村试验田进行,供试土壤为砂壤土,前茬作物为水稻。试验田地势平坦,肥力均匀,土壤pH值5.38,有机质28.66g/kg,速效钾85.71mg/kg,速效磷34.22mg/kg,碱解氮120mg/kg,供试品种为当地主栽雪茄烟品种德雪一号。当地常规种植密度为24 000株/hm²,行距110cm,株距38cm。

试验共设置5个处理：18 000株/hm²,行距120cm,株距46cm（T1）;19 500株/hm²,行距120cm,株距43cm（T2）;21 000株/hm²,行距120cm,株距40cm（T3）;22 500株/hm²,行距110cm,株距40cm（T4）;24 000株/hm²,行距110cm,株距38cm（T5）。每个处理设3次重复,共15个小区,小区面积200m²。田块周围设保护行,小区间设0.5m宽过道。

烟株于2019年4月30日移栽,移栽后55d打顶,留叶数18~20片。氮肥水平为总施氮量150kg/hm²（N∶P₂O₅∶K₂O为1∶0.5∶2）,肥料为当地烟草公司提供的烟草专用复合肥375kg/hm²（N∶P₂O₅∶K₂O=10∶20∶20）、硝酸钾农业肥675kg/hm²（N∶P₂O₅∶K₂O=13∶0∶46）和河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地提供的烟草高炭基肥750kg/hm²（N∶P₂O₅∶K₂O=1.7∶0∶0）。肥料分别于植株移栽前以及移栽后30d条施于试验田中。基肥与追肥比例为7∶3。田间管理与后续调制按当地雪茄烟生产技术标准统一进行。

1.3.1 田间微环境 自打顶后7d开始,每7d在各小区使用五点取样法于上午10∶00-11∶00气候稳定时测定。使用WS-2020温湿度表（江苏龙禾电子有限公司）在距地面20cm处测定垄间温湿度;使用TES1332A数字式照度计（泰仕电子工业股份有限公司）在烟株从下至上10~12片烟叶处测定烟叶接收的光强。

1.3.2 丙二醛（MDA）含量 自打顶后7d开始,每小区选取长势均匀的烟株20株进行挂牌标记,每7d选取烟株从下至上10~12片烟叶,在叶片中部剪取0.1g叶片放入液氮保存,然后采用双组分分光光度计法测定烟叶MDA含量^[12],每个处理重复3次。

1.3.3 抗氧化酶活性 取样及保存方法同1.3.2,采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性^[13]、分光光度法测定过氧化氢酶（CAT）活性^[14]以及NBT光还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性^[15],每个处理重复3次。

1.3.4 烟叶常规化学成分 取各处理调制后中部三等烟叶各1kg,于60℃烘干,研磨粉碎后过60目筛,称取0.25g烟样于50mL小白瓶中,加入25mL 5%醋酸溶液,震荡30min后用定性滤纸过滤,采用流动分析法测定滤液中烟草常规化学成分^[16]。

1.3.5 烟叶感官质量 取各处理调制后中部三等烟叶按照YC/T 138-1998的方法对雪茄烟样品进行感官质量的测定,并按表1雪茄烟感官质量评分权重加权计算总分。

1.3.6 烟叶经济性状 按四川省当地雪茄烟收购分级标准测定发酵后的烟叶产量、均价和茄衣比例。

采用Microsoft Excel 2010软件作图,利用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析与相关性分析。

由表2可知,在同一时间下田间温度随种植密度的增大而升高。T5处理成熟期内温度最高,达到38.90℃。T2、T3和T4处理在打顶后7~14d田间温度未出现显著性差异,可能是由于打顶后前期烟株中上部叶面积较小,对田间环境的影响较小。在打顶后21d,随着烟叶叶面积增大,T3处理与T4、T2的田间温度出现显著性差异。打顶后35d,T4和T5处理与其他处理的田间温度出现显著性差异同一时期内相对湿度随密度增大而逐渐增大,打顶后14d开始,各处理间出现显著性差异。随着烟叶种植密度增大,烟叶的蒸腾作用增强,同时田间通风降低,田间湿度逐渐增加。打顶后35d,T5处理相对湿度较T1处理增加了16%。

同一时期内光照强度随密度升高而降低,打顶后7d,T1处理与T3、T4、T5处理之间存在显著性差异。随着烟叶生长,上部叶对阳光的遮挡程度逐渐加大,打顶后35d,T1与T2处理之间存在显著性差异,T3与T4处理之间存在显著性差异,T2与T3之间无显著性差异。打顶后7dT5处理烟叶光照强度一直处于较低水平,与T1和T2处理存在显著性差异。打顶后35d,T5处理光照强度较T3处理降低了26.5%,且与T1、T2和T3处理存在显著性差异。

MDA作为膜脂过氧化反应的最终产物,其含量的高低一定程度上可反映烟叶内膜脂过氧化程度的高低。由图1可知,成熟期内T1、T2、T5处理烟叶MDA含量呈现先降后升的趋势;T3和T4处理呈现逐渐上升趋势。在打顶后7d,T3、T4处理与T1、T2和T5处理出现显著性差异,在21d后,随着下部烟叶开始采收,烟株营养向中上部叶转移,各处理MDA含量增加速度明显加快。同一时期内T3和T4处理MDA含量仍处于较低水平。

T1处理MDA含量在各处理中均最高。之后T4、T5处理MDA含量增长速度明显升高,打顶后35d,T4和T5处理MDA含量显著高于T3处理。说明T3处理成熟期烟叶膜脂过氧化程度较轻,有利于烟叶内含物质转化及其生长发育。

由表3可知,各处理下烟叶膜脂过氧化水平与田间温度均呈显著正相关关系,其中除T5外,其他处理温度与烟叶膜脂过氧化程度极显著相关（P<0.01）,T5处理与其显著相关（P<0.05）。T1处理烟叶膜脂过氧化程度与湿度呈负相关,但未达显著水平。T1处理MDA含量与光照强度呈显著正相关,说明此时烟叶所受光强过大,从而影响相关抗氧化酶活性,造成烟叶膜脂过氧化程度加大。T2、T3、T4和T5处理湿度、光强与烟叶膜脂过氧化程度之间无显著相关性。

如图2所示,同一处理的POD、CAT、SOD活性均呈现先升后降的变化趋势。各处理POD活性在打顶后28d达到最高值,之后开始下降。此时各处理差异开始增大。成熟期内整体上各处理POD活性以T3处理较高,T1处理最低。打顶后14d,T3处理POD活性显著高于T4处理。打顶后28d,T3、T4与其他处理出现显著性差异。

各处理CAT活性在打顶后14d达到最高值,此时T3处理酶活性最高,达到228.83U/(mg·min),打顶后21d,T2、T3和T4处理CAT活性显著高于T1和T5处理。打顶后28d,T3处理CAT活性显著高于T4处理,T5处理CAT活性显著低于其他处理。打顶后35d各处理间皆出现显著性差异,T3处理CAT活性最高,为87.69U/(mg·min),T1处理最低,为26.44U/(mg·min),T1较T3处理降低了69.8%。

T3处理SOD活性在打顶后21d达到最大值,之后开始下降。同一时期均以T3处理SOD活性最高,T1处理活性最低,在打顶后7d,T3处理SOD活性显著高于其他处理,在打顶后21d,T3与T1、T2、T5处理出现显著性差异。打顶后28d和35d,T3处理与其他各处理皆出现显著性差异。

由表4可以看出,烟叶中总糖和还原糖含量随种植密度的增大呈现先升高后降低的趋势。T3处理烟叶总糖和还原糖含量最高,分别为1.86%和0.67%,且显著高于T1和T5处理。当种植密度高于22 500株/hm²时,烟叶总糖含量显著下降。T3处理总糖含量较T5处理增加了53.7%。烟碱含量随种植密度的增大整体呈降低趋势,T1处理烟碱含量显著高于T5处理。各处理钾含量在2.24%~3.65%之间,其中T1处理最高,为3.65%,T1和T3处理钾含量显著高于T2、T4和T5处理。氯含量各处理间差异较小,且均处于较低水平,与四川省土壤中氯含量较低有关。优质雪茄烟化学成分适宜范围为总糖2%左右、总氮4%~6%、烟碱2.8%~3.8%、钾≥2%、氯0.3%~0.6%、钾氯比≥6^[17,18]。结合优质雪茄烟化学成分可知,四川省雪茄烟相比于优质雪茄烟总糖含量较低,其余各指标皆处于优质雪茄烟适宜范围内。总氮含量较适宜,钾氯比较高,烟叶燃烧性较好,适宜性指标中由于烟叶总糖含量较低,糖碱比较低,影响其吸食品质。各处理中T3处理总糖含量较高,糖碱比较大,钾氯比较高,烟叶刺激性小,燃烧性较好,有利于改善四川省雪茄烟糖含量较低的缺点。

由表5可知,感官质量得分以T2和T3处理最高。T4和T5处理相比T3处理烟叶烟气浓度有所下降,烟灰杂质有所增加,总分明显降低。

由表6可知,烟叶产量随种植密度的增大呈先升后降的趋势,其中T4处理烟叶产量最大,但烟叶均价、产值和茄衣比例均以T3处理最佳,且显著高于T5处理（当地现行常规种植密度24 000株/hm²）。综合对比各处理烟叶经济性状以T3处理最佳。

同一时期温度随种植密度的增大而升高。各处理温度均与烟叶膜脂过氧化程度呈显著正相关关系,说明成熟期内温度超过了雪茄烟正常生长发育所需的温度范围,加大了烟叶的膜脂过氧化程度。赵松超等^[19]研究表明种植密度增大时田间温度升高,与本试验研究结果一致。但穰中文等^[20]的研究结果表明当烟株种植密度过大时,由于叶面所受光照被上部叶遮挡,造成垄间温度有所下降,本试验中并未出现密度增大而温度下降的现象,可能是试验地点不同,环境气候有所改变,以及雪茄烟叶面积较烤烟较小所致。

在T1处理下,光照强度与烟叶膜脂过氧化程度呈正相关关系,表明烟叶在此密度下受高光强影响从而加深了膜脂过氧化程度。湿度与烟叶膜脂过氧化程度未出现相关关系,说明此时各处理湿度处在烟叶生长的适宜范围内。综上所述,除T1处理受高光强度影响外,其余处理主要受到高温影响,从而加深烟叶膜脂过氧化程度,但T2处理温度并未与T3和T4处理出现显著性差异,故可得烟叶在19 500~22 500株/hm²密度下其田间微气候较适宜烟叶生长。

植物细胞中活性氧的清除主要依靠SOD、CAT和POD互相协同。SOD能够清除细胞内的超氧阴离子,POD和CAT可以使H₂O₂歧化成无毒的水和氧分子,从而减轻植物膜脂过氧化程度^[21]。本试验结果表明,各处理抗氧化酶活性随烟叶成熟度变化皆为先升高后降低,这可能是由于烟叶进入成熟期后细胞内活性氧分子增多,刺激抗氧化酶相关基因的表达,使得相关酶活性开始上升^[22],后期出现下降则可能是因为细胞内活性氧分子含量过高,超出细胞的承受范围,破坏了细胞膜结构,影响了相关蛋白质以及其他物质的合成^[23]。18 000株/hm²种植密度下烟叶在高光强影响下光合作用加强,叶片衰老加快,从而破坏了抗氧化酶系统,使成熟后期POD、SOD和CAT活性降低,加剧了烟叶膜脂过氧化程度。随着种植密度的增大,烟叶所受光照强度减小,烟叶CAT与POD活性逐渐提升,烟叶膜脂过氧化程度有所降低,此结果与朱大恒等^[24]的研究结果一致。当种植密度大于19 500株/hm²时光照强度与烟叶膜脂过氧化程度不再具有显著相关性。

种植密度19 500~22 500株/hm²时烟叶抗氧化酶活性高于18 000株/hm²,且随着烟叶逐渐成熟,其抗氧化酶活性差异逐渐增大。当种植密度高于22 500株/hm²时抗氧化酶活性出现降低趋势,表明烟叶在高种植密度下温湿度等因素对烟叶抗氧化酶系统造成一定影响,且雪茄烟烟叶在成熟时其叶长在50~60cm之间,24 000株/hm²密度下株间距为38cm,此时中部烟叶会受上部烟叶遮挡而无法得到较充足的光照,且田间通风受到影响,其抗氧化酶活性也会有所下降。李美茹等^[25]的研究结果也表明,弱光环境下的植物其抗氧化能力较正常光照范围有所下降。综上所述,种植密度为21 000株/hm²时烟叶抗氧化酶活性水平较高,烟叶膜脂过氧化程度较低,有利于烟叶成熟期内清除细胞内生成的大量活性氧分子,维持烟叶正常的代谢活动及生长发育。

烟叶化学成分是衡量烟叶品质最主要的依据之一,由于雪茄烟调制过程较长,糖类物质损耗较多,而烟碱和总氮含量较高,烟叶接近碱性。国内优质雪茄烟化学成分评价尚未形成规范完备的评价标准,对比国内外优质雪茄烟产区与本试验各处理烟叶的雪茄烟化学成分,总糖含量低是四川省雪茄烟存在的主要问题,这可能与四川省打顶时期较早有关,海南省打顶时期为移栽后60d,而四川省打顶时期在打顶后55d左右,也可能是由四川省雪茄烟种植密度过高,成熟期内含物质积累不足造成的。

曹阳等^[26]研究表明,适当增大种植密度对烟叶总糖、总氮和钾含量有一定提升。而本试验发现,总糖、还原糖和钾含量随种植密度的增大呈现先升高后降低的趋势,在中等种植密度时,烟叶总糖和还原糖含量最高,这可能是由于种植密度过高时,温度过高、光强过低和烟株根系发育不良等因素影响了烟叶相关物质的合成与代谢。而烟碱含量随种植密度的增大呈现先上升后下降的趋势,这与朱命阳^[27]的研究结果一致。

感官评吸质量也以T3处理最好,其烟气浓度适中,香气质好,香气量较充足,劲头适中,刺激性较小,余味舒适。5个处理中T3处理产量虽较T4处理稍低,但烟叶均价、产值和茄衣比例均为最佳,且显著高于常规种植密度。综合比较,T3处理烟叶化学成分最协调,感官质量最佳,经济性状最好。

种植密度对成熟期雪茄烟生长环境有显著影响,其中高温是造成烟叶膜脂过氧化水平增大的主要因素,应适当降低密度,保持田间通风。当种植密度为21 000株/hm²时烟叶抗氧化酶活性较高,膜脂过氧化程度较低,总糖含量较高,烟碱含量较适宜,钾氯比较高,化学成分较为协调,感官质量得分最高。经济性状方面烟叶产值及茄衣比例皆以21 000株/hm²密度下表现最好,与当地常规种植密度24 000株/hm²相比,21 000株/hm²下烟叶产值与茄衣比例分别提升了0.9万元/hm²与7%。综上所述,种植密度为21 000株/hm²时烟叶抗氧化能力较强,烟叶品质较好,产值及茄衣比例均有所提升,为四川省雪茄烟适宜种植密度。