作物杂志, 2023, 39(4): 22-30 doi: 10.16035/j.issn.1001-7283.2023.04.004

遗传育种·种质资源·生物技术

水稻粉质胚乳突变体cse的表型分析及基因定位

花芹,1, 林泉祥1, 宋远辉1, 孙家猛1, 张祖普2,3, 陈庆全1, 李金才1, 张海涛,1

1安徽农业大学农学院,230036,安徽合肥

2江苏红旗种业科技有限公司,225311,江苏泰州

3江苏省(红旗)稻麦良种繁育工程技术研究中心,225311,江苏泰州

Phenotypic Analysis and Map-Based Cloning of Chalkiness and FlouryEndospermMutantcsein Rice (Oryza sativa L.)

Hua Qin,1, Lin Quanxiang1, Song Yuanhui1, Sun Jiameng1, Zhang Zupu2,3, Chen Qingquan1, Li Jincai1, Zhang Haitao,1

1College of Agronomy, Anhui Agricultural University, Hefei230036, Anhui, China

2Jiangsu Hongqi Seed Co., Ltd., Taizhou225311, Jiangsu, China

3Jiangsu Province (Hongqi) Engineering Research Center for Rice and Wheat Seed Breeding, Taizhou225311, Jiangsu, China

通讯作者: 张海涛,研究方向为作物遗传育种,E-mail:43647174@qq.com

收稿日期: 2022-03-9   修回日期: 2022-05-28  

基金资助: 国家自然科学基金(31871603)
国家留学基金委项目(201708340008)
安徽省科技厅项目(KJ2017A143)
安徽省科技厅项目(gxfxZD2016022)
江苏现代农业产业体系(JATS[2021]295)

Received: 2022-03-9   Revised: 2022-05-28  

作者简介 About authors

花芹,研究方向为作物遗传育种,E-mail:2227028367@qq.com

摘要

利用突变体挖掘与稻米品质相关基因,有助于阐明与品质相关的淀粉和贮藏蛋白生物合成的调控机制,促进水稻优质育种。通过筛选中花11组织培养突变体库,获得具有粉质、垩白和皱缩外观胚乳的突变体csechalkinessandshrunkenendosperm),并进行籽粒表型鉴定和理化性质分析。通过F2群体分析cse遗传行为和目的基因的图位克隆,利用qRT-PCR分析基因的时空表达模式。与野生型相比,突变体的农艺性状和淀粉理化性质均有显著差异,突变体淀粉颗粒呈不规则球型,且相互间隙较大。遗传分析表明,突变体性状受单隐性核基因控制。借助图位克隆将候选基因定位在4号染色体长臂端Os4-14-8和Os4-15之间的40kb范围内。测序结果表明,定位区间内仅有一个编码TPR蛋白的候选基因LOC_Os04g55230发生了突变。第1个外显子处缺失3个碱基GGC,导致一个甘氨酸缺失,第14个外显子处存在1个碱基G替换成碱基A,导致精氨酸突变为赖氨酸。qRT-PCR结果表明,LOC_Os04g55230在授粉后14d的胚乳中表达量达到最大值。突变的LOC_Os04g55230为已报道基因OsFLO2/OsCNY8的新等位基因,但突变体与已知的OsFLO2突变体表型不完全相同,cse籽粒伴有皱缩外观,有效分蘖数、贮藏蛋白和脂肪酸含量等均显著增加。

关键词: 水稻(Oryza sativa L.; 粉质胚乳; 淀粉颗粒; 理化性质; 图位克隆

Abstract

It is helpful to clarify the genetic regulatory mechanism of starch and storage protein biosynthesis related to quality and promote rice quality breeding by using mutants related to rice quality. The chalkiness and shrunken endosperm mutantnamed cse was obtained by screening a mutant library of tissue culture of Zhonghua 11, and the phenotype identification and physicochemical properties analysis of grains were carried out. Analysis of genetic behavior of cse and map-based cloning of target gene by F2 population. qRT-PCR was used to analyze the spatiotemporal expression pattern of relatedgenes.Compared with the wild type, the mutant showed significantly different in agronomic traits and starch physicochemical characteristics. The mutant starch granules were irregularly spherical with large interspaces. Genetic analysis showed that the mutant trait was controlled by a pair of recessive nuclear genes. Map-based cloning revealed that cse is located on the long arm of chromosome 4 between Os4-14-8 and Os4-15 with a physical interval of 40kb. Sequencing results showed that only one candidate gene LOC_Os04g55230 encoding TPR protein had mutation in the mapping interval. The deletion of three bases GGC in the first exon led to the deletion of one glycine, and the substitution of one base G in the fourteenth exon for base A led to the mutation of arginine to lysine. The results of qRT-PCR showed that the expression level of LOC_Os04g55230 reached the maximum in endosperm 14 days after fertilization.The mutant LOC_Os04g55230was a new allele of the reported gene OsFLO2/OsCNY8, but the phenotype of the mutant was not completely same as the known OsFLO2 mutant. The cse grains had shrunken appearance, and the effective tiller number, storage protein and fatty acid content were significantly increased.

Keywords: Rice(Oryza sativa L.); Floury endosperm; Starch granules; Physicochemical characteristic; Map-based cloning

PDF (3803KB) 元数据 多维度评价 相关文章 导出 EndNote| Ris| Bibtex  收藏本文

本文引用格式

花芹, 林泉祥, 宋远辉, 孙家猛, 张祖普, 陈庆全, 李金才, 张海涛. 水稻粉质胚乳突变体cse的表型分析及基因定位. 作物杂志, 2023, 39(4): 22-30 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2023.04.004

Hua Qin, Lin Quanxiang, Song Yuanhui, Sun Jiameng, Zhang Zupu, Chen Qingquan, Li Jincai, Zhang Haitao. Phenotypic Analysis and Map-Based Cloning of Chalkiness and FlouryEndospermMutantcsein Rice (Oryza sativa L.). Crops, 2023, 39(4): 22-30 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2023.04.004

水稻(Oryza sativa L.)作为重要的粮食作物,其胚乳主要由近80%淀粉和10%贮藏蛋白组成,为人类日常膳食提供重要能量。淀粉的生物合成和贮藏蛋白积累直接影响稻米的外观、产量和食味品质。

胚乳发育中贮藏物质的合成受复杂基因调控。淀粉中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶催化葡萄糖-1-磷酸和ATP而产生活化的葡萄糖基供体ADP-葡萄糖和焦磷酸[1]。随后在歧化酶、淀粉磷酸化酶、可溶性淀粉合酶、颗粒结合淀粉合酶I、淀粉分支酶和淀粉脱支酶等催化协同酶的作用下合成[2]。这些关键酶的缺失有可能导致胚乳皱缩[3]、黏稠[4]、白核[5]、粉质[6]和暗淡[7]等异常表型。其中白核和粉质等突变胚乳常表现为淀粉粒的数量、大小与排列等变异。SSG6编码一种转氨酶同源蛋白,其突变体ssg6成熟核淀粉颗粒增大,但千粒重显著下降且呈轻微粉质状[8]fse1flo6中出现较小的淀粉粒且排列松散,导致胚乳呈粉质状态[9-10]FLO19编码一个定位在质体的丙酮酸脱氢酶复合物E1组分亚基α1,该基因突变导致复合型淀粉颗粒减少,单粒型淀粉颗粒增多,导致籽粒内胚乳呈不透明状[11]。除合成淀粉外,粉质胚乳表型也与贮藏蛋白积累有关。谷蛋白合成相关的基因GPA4、GPA5GPA6发生突变均呈现粉质外观。GPA4编码一个保守膜蛋白GOT1B,通过与Sec23蛋白特异性互作调控COPII(coat protein complex II)组装,积累57kD的谷蛋白前体,形成2种异常的Ⅰ型蛋白体,gpa4-1突变体的种子中蛋白含量显著降低[12]GPA5编码一种植物特有的PX(phox-homology)结构域蛋白,与Rab5a和VPS9a协同互作调控密集囊泡介导的后高尔基体向蛋白贮藏液泡的运输[13]GPA6编码一个Na+/H+反向转运体OsNHX5,gpa6只有部分谷蛋白被转运到II型蛋白体中,导致II型蛋白体减小[14]。此外,一些基因突变导致淀粉与蛋白合成均受影响,形成粉质胚乳。转录因子OsNAC20OsNAC26双突变体表现为淀粉和贮藏蛋白含量显著下降,呈现粉质胚乳[15]FLO2编码一个具有3个四肽重复基序(TPR)蛋白,TPR包含2个反向平行的α-螺旋结构,作为容纳靶蛋白的互补区域,与多个目标蛋白同时发生相互作用[6]。突变体中与FLO2相关的参与淀粉和贮藏蛋白生物合成的许多基因的表达水平显著降低,产生异常胚乳,表现为暗色和粉质特征,胚乳中贮藏物质含量减少,籽粒变小,F1种子育性降低[16-17]

虽然水稻粉质胚乳成因研究取了一定进展,但相关基因调控网络仍不明晰,仍需进一步发掘相关品质突变体,阐明淀粉和贮藏蛋白的生物合成与调控机制,促进优质水稻育种。本文通过筛选中花11组织培养突变体库,获得一个呈粉质、垩白和皱缩外观胚乳的突变体csechalkinessandshrunkenendosperm)。对突变体进行表型观察、理化性质测定、遗传分析、基因定位和候选基因克隆等研究,发现cseflo2的一个新等位变异。

1 材料与方法

1.1 试验材料与定位群体构建

水稻粉质胚乳突变体cse来源于粳稻(OryzasativaL. ssp. japonica)品种中花11的组织培养。自然环境下,连续多代自交和田间考察发现,突变性状能够稳定遗传。将其与粳稻品种IRAT129配制杂交组合获得F1。F1自交获得F2,F2群体用于遗传分析和基因定位。亲本、F1杂交种和F2群体材料均播种于安徽农业大学国家高新技术农业园(合肥),单株种植,株行距为18cm×25cm,田间管理同大田生产。其中亲本各种植8行,每行10株,设3次重复,观察并记录分析水稻各生育期亲本间形态特征及农艺性状差异,并进行单株收获。利用JLGJ-45型电动砻谷机(大吉光电,杭州)去除颖壳后,统计群体中正常表型单株和突变体表型单株的分离比,选取极端个体用于精细定位。利用SPSS 20.0软件进行统计分析。

1.2 籽粒干物质积累测定

在中花11和突变体穗部颖花开花后第3、7、14、21、28d剪取穗顶部籽粒,置于105℃烘箱杀青30min后,在80℃恒温干燥箱中烘至恒重,脱除颖壳后测量干重,每个样品设置10次重复[18]

1.3 碘染与扫描电镜

亲本种子去稃后用超纯水浸润12h,横切并滴加2% I2-KI溶液染色,并置于尼康S261-60型体视镜下观察并拍照记录。扫描电镜观察参照Zhang等[19]方法,使用E1010型离子溅射仪(日立,日本)在断面镀上碳膜,采用S-4800型高分辨率扫描电子显微镜(日立,日本)观察并拍照。

1.4 成熟种子的理化性质测定

去壳籽粒采用200T型高速多功能粉碎机研磨成糙米粉,过100目筛,50℃恒温箱中烘至恒重备用。采用A1481-1植物淀粉含量试剂盒测定总淀粉含量;参照标准米质方法NY147-88测定直链淀粉含量[20];参照龙武华[21]的方法测定总蛋白含量;参照蒽酮比色法[22]测定可溶性糖含量;采用DA7200型近红外快速分析仪(Perten,美国)测定糙米中脂肪酸、垩白度、碱消值和胶稠度[23];使用Pyris DSC8000型差示扫描热量仪(Perten,美国)测定淀粉糊化特性[24]。参照于艳芳等[25]的方法测定尿素膨胀体积。每个样本进行3次生物学重复。

1.5 目的基因定位与分子标记的开发

SSR和Indel分子标记的开发利用Gramene(http://www.gramene.org)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站数据库下载日本晴和9311序列,通过BLAST对比插入/缺失位点,利用Primer3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0)开发分子标记,并由南京擎科生物科技有限公司合成。利用筛选出具有多态性的均匀分布于12条染色体的197对SSR和Indel分子标记。选取F2群体中具有粉质胚乳表型的种子,用3% H2O2浸泡30min破除休眠后,置于RXZ-50CD型智能人工气候箱(江南仪器,浙江)培养至三叶期,采用CTAB法[26]提取叶片总DNA,构建CSE定位的DNA混池,寻找与目标基因的连锁位点,在此基础上利用F2和F3群体进行目标基因的初步定位。再开发新的标记,扩大定位群体,对目标基因进行精细定位(表1)。10µL PCR反应体系如下,2×Taq PCR StarMix 5µL、正反向引物(10µmol/L)各1µL、DNA模板1µL、10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP,polyvinylpyrrolidone)1µL和ddH2O 1µL。PCR反应条件为94℃预变性2min;94℃变性30s,退火温度55℃~60℃退火30s,72℃延伸1min,共计35个循环;最后72℃下终延伸5min,4℃保存。PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、0.1% AgNO3染色后在3%的甲醛和NaOH中显色,观察拍照并记录基因型[27]

表1   引物信息

Table 1  Information of primers

名称Name类型Type正向引物序列(5′-3′)Forward primer sequence (5′-3′)反向引物序列(5′-3′)Reverse primer sequence (5′-3′)
Os4-10定位ACCTTTTCTTGGCTTGAGGGGCTTTTGCTACTTTTGGGGG
Os4-11定位ACGTCCATGTCGGTGTACGCCACCACCTCTACTTCTTCAGTG
Os4-12定位ACGGAAACGTAGGTGGTCTGACCCGCTAGCTCTTCGATCT
Os4-13定位TTGGTTGCTTCCTCCCATACGGCATTGTACGACGGATCTC
Os4-14定位ACTGTGGAGTACAGGTCGGCGAAACGGAAACGAAACCCTC
Os4-15定位CCGCTACTAATAGCAGAGAGGGAGCTTTGTTCTTGCGAAC
Os4-10-13定位TCGAAGGACCTTGTGTGATTCCTAGCTATGTTTGCCGAATATTG
Os4-12-11定位CAGGTCAAAACTCCTCACGCTGCAGAGTGGCTTTCAATGG
Os4-13-16定位CTCGAAAGTATAGACAGACAGCTACTACTCCTCCCTCTCGTGA
Os4-14-8定位GTATTATGCTAACGTCAGCATGCTAGGTGTCAGCATGGTACTG
Os4-15-5定位CACCGAATCACCTAAGAATAGCTGAATTCACTAATTCTGTCTC
Primer 1实时荧光定量PCRCATTCTGAAGGATGAAGTGGTTCACTCAGACATCGCTAGTACTCAG
Ubiquitin实时荧光定量PCRGCCCAAGAAGAAGATCAAGAACGACTTTTATGCTTCCGTTGTTATCT

新窗口打开| 下载CSV


1.6 RNA提取与Real-time PCR表达分析

取野生型和突变体三叶期叶片、根、茎、旗叶、花后3、7、14、21和28d穗,于-80℃保存,使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(擎科)提取总RNA,超微量分光光度计(DENOVIX,美国)检测浓度。RNA反转录试剂盒(艾瑞科)获得cDNA。利用CSE的CDS设计荧光定量PCR引物,水稻基因UbiquitinLOC_Os03g13170)作为内参(表1)。反应体系采用莫纳生物科技有限公司试剂盒MonAmpTM ChemoHS qPCR Mix(MQ00401),20µL反应体系为0.4µmol/L的正、反向引物、MonAmpTM ChemoHS qPCR Mix以及适宜浓度的cDNA;在BIO-RAD CFX96TM型荧光定量PCR仪(BIO-RAD,美国)上进行扩增反应,反应条件为:95℃预变性10min;95℃变性10s,60℃延伸30s,40个循环。每个样品重复3次,用2-△△CT法计算CSE的表达量[28]

2 结果与分析

2.1 突变体表型分析

水稻粉质胚乳突变体cse在合肥经多年种植性状稳定。与野生型相比,cse在营养生长阶段分蘖数显著增加48.0%;生殖生长阶段,生长较缓慢,株高显著降低,主要表现在第3、4节间分别缩短29.4%和40.0%、穗长缩短7.9%(表2图1a~c)。考种结果(表2)表明,cse二次枝梗数和结实率分别降低29.7%和3.0%。cse成熟干燥颖果表现为轻微皱缩,胚胎外围呈透明状,内胚乳粉质垩白不透明;而野生型颖果饱满,胚胎轮廓清晰,胚乳硬质呈透明状(图1e~f)。与野生型相比,cse成熟籽粒的粒宽和粒厚显著降低,千粒重仅为野生型的62.0%(图1d表2)。此外,我们分析了野生型和cse颖果发育过程中干重变化。从授粉后7d开始,cse千粒重极显著低于野生型,并且随着籽粒的发育千粒重间差异逐渐扩大(图2)。以上结果表明,cse的突变不仅影响植株的发育,也影响籽粒的灌浆速率。

表2   野生型和突变体农艺性状比较

Table 2  Comp arison of agronomic traits between the wild type and cse

农艺性状
Agronomic trait
野生型
Wild type
突变体
cse
株高Plant height(cm)110.20±1.88101.00±1.06**
主茎穗长Main panicle length (cm)23.84±0.3421.94±0.56*
第1节间长
The first internode length (cm)
43.31±0.8541.53±0.40
第2节间长
The second internode length (cm)
22.40±0.4019.62±0.56
第3节间长
The third internode length(cm)
13.64±0.759.61±1.05**
第4节间长
The fourth internode length (cm)
7.50±0.954.51±0.46**
有效分蘖数Effective tiller number10.02±0.6314.83±0.43**
一次枝梗数Primary branch number13.33±1.0513.40±0.91
二次枝梗数Secondary branch number43.57±3.3331.25±2.32**
穗粒数Grain number per panicle243.88±22.03172.12±14.21**
粒长Grain length(mm)7.83±0.047.30±0.07*
粒宽Grain width (mm)3.70±0.103.37±0.04**
粒厚Grain thickness (mm)2.33±0.092.03±0.05**
千粒重1000-grain weight (g)28.95±0.0518.28±0.10**

*”表示在P< 0.05水平上差异显著,“**”表示在P< 0.01水平上差异显著,下同

*”indicates significant difference at P< 0.05 level,“**”indicates significant difference at P< 0.01 level, the same below

新窗口打开| 下载CSV


图1

图1   野生型和突变体cse的表型鉴定

(a) 抽穗期的植株形态;(b) ZH11(左)与cse(右)成熟节间;(c) 蜡熟期穗部形态;(d) 籽粒大小;(e) ZH11(外)与cse(内)成熟颖果外观;(f) 成熟颖果横截面。ZH11:中花11

Fig.1   Phenotypic characterization of wild type and thecse

(a) Plant morphology at heading stage; (b) Mature internodes of ZH11 (left) and cse (right); (c) Panicle morphology at ripening stage; (d) Grain size; (e) Mature grain appearance of ZH11 (outside) and cse (inside); (f) Cross-sections of mature grains. ZH11: Zhonghua 11


图2

图2   野生型和cse的不同时期干物质积累比较

**”表示在P< 0.01水平上差异极显著,下同

Fig.2Dry   matter accumulation in wildtype and cse at different stages

**”indicates extremely significant difference at P< 0.01 level, the same below


2.2 胚乳淀粉颗粒染色与结构分析

野生型糙米横截面呈透明状且质地紧密,而突变体糙米横截面呈粉质状态且质地疏松。经2%的I2-KI染色发现,突变体着色较野生型浅(图3a~b),表明cse淀粉含量较野生型更低。利用扫描电镜观察野生型和cse成熟颖果横断面显示,野生型胚乳淀粉颗粒紧密堆积、呈规则的多边形晶体结构(图3c);而cse淀粉粒呈不规则球形且淀粉颗粒间缝隙较大,排列疏松,多以单一、分散的淀粉粒存在(图3d)。上述结果表明,cse对胚乳中淀粉颗粒的发育至关重要。

图3

图3   野生型和cse的成熟胚乳碘染和扫描电镜观察

a和b:野生型与cse胚乳碘染比较;c和d:野生型与cse扫描电镜观察

Fig.3Iodi   ne staining and SEM observation of mature endosperm between wild type and cse

a, b: endosperm staining comparison between the wildtype and cse; c, d: SEM observation of mature endosperm of wildtype and cse


2.3 成熟籽粒的理化性质分析

由于cse胚乳中淀粉发育异常,我们还检测了成熟籽粒的理化性质。与野生型相比,cse的总蛋白质、脂肪酸和可溶性糖含量分别极显著增加21.5%、83.7%和34.8%,垩白度增加340%;但总淀粉含量降低22.2%,且直链淀粉含量(8.8%)仅为野生型(17.6%)的49.9%(表3)。直链淀粉含量通常与糊化温度、胶稠度相关。cse直链淀粉含量降低,其起始糊化温度、峰值、结束温度和焓变量也分别显著降低6.9%、5.1%、3.1%和28.3%(表4),糊化温度的关键指标碱消值也相应降低6.2%,但胶稠度增加11.2%。糊化特性影响米粉溶解性,尿素膨胀试验结果表明,两者在5mol/L出现明显膨胀现象(图4),但突变体的米粉膨胀体积变化始终低于野生型。以上结果说明,cse突变影响了水稻颖果中淀粉和贮藏蛋白的累积,进而改变胚乳淀粉的理化性质。

表3   野生型和突变体理化性质比较

Table 3Phys  icochemical properties comparison between the wild type and cse

指标Index野生型Wild type突变体cse
蛋白质Protein (%)9.31±0.1811.29±0.21**
总淀粉Total starch (%)83.70±0.3373.90±0.28**
直链淀粉Amylose (%)17.65±0.488.81±0.25**
可溶性糖Soluble sugar (%)4.64±2.386.21±0.57**
脂肪酸Fatty acid (%)14.13±0.7725.96±0.38**
垩白度Chalkiness (%)17.23±0.2476.84±2.30**
碱消值Alkali spreading value8.06±0.277.64±0.08**
胶稠度Gel consistency (mm)58.03±0.3564.52±0.30**

新窗口打开| 下载CSV


表4   野生型和突变体糙米粉的热特性参数

Table 4Ther  mal parameters of the wild type and cse

材料
Material
起始温度
T0 (℃)
峰值
TP (℃)
结束温度
TC (℃)
焓变
∆H (J/g)
野生型
Wild type
66.60±0.65**71.96±0.45**76.09±0.29**7.18±0.83**
cse61.98±0.5468.31±0.4373.76±0.505.15±0.30

新窗口打开| 下载CSV


图4

图4   野生型和cse的尿素膨胀分析

(a) 野生型与cse尿素膨胀试验;(b) 不同尿素浓度下野生型和cse米粉的膨胀体积比较

Fig.4   The swollen volume of wild type and cse starch in urea solutions of various concentrations

(a) The swollen volume of wildtype and cse starch in urea solutions of various concentrations; (b) The swollen volume of wild-type and cse starch in urea solutions of various concentrations


2.4 cse遗传分析

cse为母本,以粳稻品种IRAT129为父本配制杂交组合,F1籽粒发育正常,F2籽粒出现正常表型和粉质胚乳表型分离。2020年随机调查F2群体212株,2021年随机调查F2群体743株(表5),cse符合3:1(χ22020、202120.05,1=3.84)的分离规律,推断cse的表型性状受1对隐性核基因控制。

表5   突变基因cse的遗传分析

Table 5  Genetic analysis of mutant gene cse

年份
Year
调查总株数
Total number of
plants investigated
野生型表型个数
Number of wild
type phenotypes
突变体表型个数
Number of mutant
phenotypes
χ2
2020212168441.81
20217435671760.68

新窗口打开| 下载CSV


2.5 粉质胚乳基因的精细定位

利用2个亲本cse和IRAT129间具有多态性的197对分子标记,对F2极端隐性表型单株构成的DNA混池进行连锁分析,发现亲本cse的带型与位于第4号染色体上标记Os4-10一致(图5a)。进一步利用Os4-10附近的标记进行连锁分析,并开发了另外5对多态性引物Os4-11、Os4-12、Os4-12-11、Os4-13和Os4-13-16,对550株F2具有粉质胚乳外观单株进行初定位,发现目标基因cse位于分子标记Os4-13和Os4-13-16之间(图5b)。基于Gramene中水稻基因序列信息,在Os4-13和Os4-13-16之间开发出4对新的SSR和Indel标记(表2),借助3034株F2隐性单株,将cse锁定在物理距离为40kb的Os4-14-8和Os4-15标记间(图5c)。

图5

图5   cse的精细定位

(a)~(d)横线的上方为定位所用的分子标记,横线下方为交换单株数,红色箭头框为目的基因;(e) 候选基因cse结构图,方框代表外显子内碱基的缺失和替换

Fig.5   Fine mapping of cse

(a)-(d) The numbers beneath the bold lines represented the recombinants identified by the corresponding markers. The red arrow box is the target gene; (e) A schematic representation of the cse gene, the boxes represent the deletion and replacement of bases in exons


Gramene (http://www.gramene.org/) 网站和Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/) 上的基因预测信息表明上述40kb候选区间内共有6个候选基因(图5d表6)。经反复测序发现,与野生型相比,cse的ORF1~5不存在碱基序列差异,但ORF6(LOC_Os04g55230)的第1个外显子处(-ATG 51bp)缺失3个碱基(GGC),导致甘氨酸缺失;第14个外显子处(-ATG 7887bp)碱基G被替换成A,导致精氨酸突变为赖氨酸(图5e)。cse编码含有四肽重复结构域的蛋白质,是已经报道[6,21]基因OsFLO2/OsCNY8的新等位基因。

表6   精细定位区间内注释基因

Table 6  Anno tated genes in the fine mapping range

开放阅读框ORF基因名称Gene name注释功能Putative function
1LOC_Os04g55180含有α/β折叠家族结构域的蛋白质
2LOC_Os04g55190含SPOC结构域的蛋白质
3LOC_Os04g55200涂层亚基
4LOC_Os04g55210氯通道蛋白
5LOC_Os04g55220含有C2结构域的蛋白质
6LOC_Os04g55230含有四肽重复结构域的蛋白质

新窗口打开| 下载CSV


2.6 CSE表达模式与同源分析

我们利用Phytozome13(https://phytozome.jgi.doe.gov)上LOC_Os04g55230序列信息,在水稻、拟南芥、小麦、玉米和大麦的基因组数据库中搜索同源蛋白,利用MEGA7.0软件对CSE及同源蛋白的氨基酸序列进行比对并构建系统进化树,发现水稻中存在2个未有相关研究报道的同源基因LOC_Os07g23990LOC_Os02g15660,同源率分别为73.5%和72.2%。拟南芥中同源基因ATFLO2AT1G15290)参与种子中贮藏物质的积累,其T-DNA插入突变体表现为种子易碎、数量减少以及千粒重降低[29]ATFLL1AT1G01320)参与叶片中淀粉合成和糖代谢[30]。因此,表明CSE是粉质胚乳相关基因(图6)。

图6

图6   CSE和CSE类蛋白的系统发育分析

Fig.6   Phylogenetic analysis of CSE (LOC_Os04g55230) and CSE-like proteins


利用Real-time PCR检测CSE在野生型中的表达模式,结果(图7)表明,CSE在检测的水稻组织包括叶片、根、茎、旗叶和不同时期发育的胚乳中均有表达,在旗叶中大量表达,授粉后14d的发育胚乳中表达量达到峰值。

图7

图7   CSE在野生型不同组织及不同发育时期胚乳的表达模式分析

Fig.7   Wildtype expressionanalysisof CSE in different tissues and endospern of different growth periods


3 讨论

水稻胚乳的淀粉生物合成和贮藏蛋白积累是一个复杂而精密的生物过程,涉及一系列酶促反应。淀粉合成受到抑制,导致胚乳细胞淀粉颗粒排列疏松,颗粒间的缝隙引起光的散射,光在穿过胚乳损失而表现为白色不透明[31]。已有多个胚乳发育基因突变导致胚乳不透明的研究报道,如FLO5WAXYBEIIb[5,32]。胚乳缺陷突变体是阐明种子发育和淀粉生物合成分子机制的宝贵资源。本研究中,我们分离并鉴定了籽粒轻微皱缩、胚乳外围轮廓清晰透明及内胚乳粉质不透明表型的cse突变体。与野生型相比,cse籽粒灌浆速率下降、结实率、千粒重和淀粉含量降低,淀粉的糊化特性和结构发生改变。扫描电镜观察显示,cse横截面质地疏松,淀粉粒呈不规则球形,淀粉颗粒间缝隙较大、多以单一、分散的形式存在且碘染色力较弱;而野生型胚乳淀粉颗粒紧密堆积,呈规则的多边形晶体结构(图3)。cse种子的横截面外观与flo7flo5/ss3a突变体相似,flo7仅在籽粒外围表现出粉状的白色胚乳,而flo5/ss3a突变体则表现出白核粉状胚乳[5,7]。淀粉合成由多个基因协同调控,因此,cse的粉质胚乳表型可能是水稻淀粉合成相关基因表达改变的共同作用。TPR结构域广泛存在于多种蛋白质中,并在蛋白质折叠、蛋白质运输、细胞周期控制和翻译后修饰等方面发挥关键作用,如编码TPR结构域的基因OsST2,对水稻分蘖起调控作用[33-34]cse的第16、17、18外显子编码3个TPR基序,但第14个外显子处存在一个碱基G被替换成碱基A,导致精氨酸突变为赖氨酸,可能造成TPR结构域功能缺陷,使总淀粉含量降低22.2%,直链淀粉含量仅为野生型的49.9%(表3)。由此推测,cse可能对淀粉的合成与积累产生影响。此外,flo2仅籽粒大小和淀粉品质降低[6],而cse还伴有植株变矮和分蘖数增加等性状,表明cseflo2的新等位基因突变体。

脂质通过调节代谢产物转运活性间接影响淀粉粒的形成。编码单半乳糖基二酰基甘油(MGDG)合酶的o5点突变导致MGDG和半乳糖基二脂酰基甘油(DGDG)减少,导致胚乳发育和淀粉合成异常[35]。此外,磷脂酸被证实与拟南芥中涉及半乳糖代谢和转运的几种蛋白结合,包括ABC脂质转运蛋白和DGD1[36]。粉质胚乳突变体fse1中总DGDG含量显著降低,但总MGDG含量有降低的趋势[9]cse胚乳发育过程中,脂肪酸含量显著增加83.7%。cse脂质组成的改变可能导致种子发育异常,进而造成淀粉合成异常。因此,脂质介导的代谢物转运可能是揭示种子淀粉积累机制的重要途径,进一步对淀粉体中淀粉合成和膜脂合成之间的功能联系研究,有助于阐明这种联系背后的分子机制。

4 结论

cse是一个从组织培养后代植株中筛选出的胚乳发育异常突变体,该突变体籽粒受粉7d后灌浆速率显著降低,成熟籽粒表现为轻微皱缩,胚胎外围呈透明状,内胚乳粉质不透明。扫描电镜结果显示,淀粉粒呈不规则球形且淀粉颗粒间缝隙较大,排列疏松,多以单一、分散的淀粉粒存在且碘染色较浅。对籽粒理化性质测定表明,突变体的蛋白质、脂肪酸和可溶性糖含量显著增加,总淀粉和直链淀粉含量降低。通过cse和IRAT129配制杂交组合的F2遗传定位群体分析表明,该性状是由1对隐性核基因控制。通过图位克隆将该基因定位于4号染色体Os4-14-8和Os4-15标记之间,物理距离为40kb。测序表明,候选区间内ORF6(LOC_Os04g55230)第1个外显子缺失3个碱基(GGC)导致甘氨酸缺失,第14个外显子内存在一个由G到A的突变,导致精氨酸突变为赖氨酸。cse编码的氨基酸改变,其蛋白功能活性受损,引起粉质胚乳表型。

参考文献

Wei X, Jiao G, Lin H, et al.

GRAIN INCOMPLETE FILLING 2 regulates grain filling and starch synthesis during rice caryopsis development

Journal of Integrative Plant Biology, 2017, 59(2):134-153.

[本文引用: 1]

Hanashiro I, Itoh K, Kuratomi Y, et al.

Granule-bound starch synthase I is responsible for biosynthesis of extra-long unit chains of amylopectin in rice

Plant Cell Physiology, 2008, 49(6):925- 933.

[本文引用: 1]

Dinges J R, Colleoni C, Myers A M, et al.

Molecular structure of three mutations at the maize sugary1 locus and their allele-specific phenotypic effects

Plant Physiology, 2001, 125:1406-1418.

[本文引用: 1]

Zhou H, Wang L, Liu G, et al.

Critical roles of soluble starch synthase SSIIIa and granule-bound starch synthase Waxy in synthesizing resistant starch in rice

Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 2016, 113 (45):12844-12849.

[本文引用: 1]

Nayeon R, Chul Y, Cheon-Seok P, et al.

Knockout of a starch synthase gene OsSSIIIa/Flo5 causes white-core floury endosperm in rice (Oryza sativa L.)

Plant Cell Reports, 2007, 26(7):1083- 1095.

[本文引用: 3]

She K C, Kusano H, Koizumi K, et al.

A novel factor FLOURY ENDOSPERM2 is involved in regulation of rice grain size and starch quality

Plant Cell, 2010, 22(10):3280-3294.

[本文引用: 4]

Kiswara G, Lee J H, Hur Y J, et al.

Genetic analysis and molecular mapping of low amylose gene du12(t) in rice (Oryza sativa L.)

Theoretical and Applied Genetics, 2014, 127(1):51-57.

[本文引用: 2]

Matsushima R, Maekawa M, Tomita K, et al.

Amyloplast membrane protein SUBSTANDARD STARCH GRAIN6 controls starch grain size in rice endosperm

Plant Physiology, 2016, 170 (3):1445-1459.

[本文引用: 1]

Long W H, Wang Y H, Zhu S S, et al.

FLOURY-SHRUNKEN ENDOSPERM1 connects phospholipid metabolism and amyloplast development in rice

Plant Physiology, 2018, 177(2):698-712.

[本文引用: 2]

Peng C, Wang Y H, Liu F, et al.

FLOURY ENDOSPERM6 encodes a CBM48 domain-containing protein involved in compound granule formation and starch synthesis in rice endosperm

Plant Journal, 2014, 77(6):917-930.

[本文引用: 1]

Lei J, Teng X, Wang Y F, et al.

Plastidic pyruvate dehydrogenase complex E 1 component subunit Alpha1 is involved in galactolipid biosynthesis required for armyloplast development in rice

Plant Biotechnology Journal, 2022, 20(3):437-453.

[本文引用: 1]

Wang Y H, Liu F, Ren Y L, et al.

GOLGI TRANSPORT 1B regulates protein export from endoplasmic reticulum in rice endosperm cells

Plant Cell, 2016, 28(11):2850-2865.

[本文引用: 1]

Ren Y L, Wang Y H, Pan T, et al.

GPA5 encodes a Rab5a effector required for post-Golgi trafficking of rice storage proteins

Plant Cell, 2020, 32(3):758-777.

[本文引用: 1]

Zhu J P, Ren Y L, Wang Y L, et al.

OsNHX5-mediated pH homeostasis is required for post-Golgi-trafficking of seed storage proteins in rice endosperm cells

BMC Plant Biology, 2019, 19 (1):295-307.

[本文引用: 1]

Wang J, Chen Z C, Zhang Q, et al.

The NAC transcription factors OsNAC20 and OsNAC26 regulate starch and storage protein synthesis

Plant Physiology, 2020, 184(4):1775-1791.

[本文引用: 1]

Wu Y P, Pu C H, Lin H Y, et al.

Three novel alleles of FLOURY ENDOSPERM2 (FLO2) confer dull grains with low amylose content in rice

Plant Science, 2015, 233:44-52.

[本文引用: 1]

Teramura H, Kondo K, Suzuki M, et al.

Aberrant endosperm formation caused by reduced production of major allergen proteins in a rice flo2 mutant that confers low-protein accumulation in grains

Plant Biotechnology, 2019, 36(2):85-90.

[本文引用: 1]

方鹏飞, 李三峰, 焦桂爱, .

水稻粉质胚乳突变体flo7的理化性质及基因定位

中国水稻科学, 2014, 28(5):447-457.

[本文引用: 1]

Zhang L, Qi Y Z, Wu M M, et al.

Mitochondrion-targeted PENTATRICOPEPTIDE REPEAT 5 is required for cis-splicing of nad4 intron 3 and endosperm development in rice

The Crop Journal, 2020, 9(2):282-296.

[本文引用: 1]

中华人民共和国农业部. 米质测定方法:NY 147-88. 北京: 中国标准出版社. 2002.

[本文引用: 1]

龙武华. 水稻粉质胚乳突变体flo8fse的基因克隆及功能分析. 南京:南京农业大学, 2017.

[本文引用: 2]

张述伟, 宗营杰, 方春燕, .

蒽酮比色法快速测定大麦叶片中可溶性糖含量的优化

食品研究与开发, 2020, 41(7):196- 200.

[本文引用: 1]

张斌. 稻米氨基酸含量的近红外定标模型的创建及应用. 杭州:浙江大学, 2010.

[本文引用: 1]

赵玲珑. PTST2基因调控水稻花粉和胚乳淀粉积累的功能解析.扬州:扬州大学, 2020.

[本文引用: 1]

于艳芳, 刘喜, 田云录, .

水稻粉质胚乳fse3突变体的表型分析及基因定位

中国农业科学, 2018, 51(11):2023-2037.

[本文引用: 1]

Murray M G, Thompson W F.

Rapid isolation of high molecular weight plant DNA

Nucleic Acids Research, 1980, 8(19):4321- 4325.

[本文引用: 1]

Sanguinetti C J, Dias N E, Simpson A J.

Rapid silver staining and recover of PCR products separated on polyacrylamide gels

Biotechniques, 1994, 17(5):915-919.

[本文引用: 1]

Livak K J, Schmittgen T D.

Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-∆∆CT method

Methods, 2001, 25(4):402-408.

[本文引用: 1]

Kihira M, Tanicuchi K, Kaneko C, et al.

Arabidopsis thaliana FLO2 is involved in efficiency of photoassimilate translocation, which is associated with leaf growth and aging, yield of seeds and seed quality

Plant Cell Physiology, 2017, 58(3):440-450.

[本文引用: 1]

Sato N, Kihira M, Matsushita R, et al.

AtFLL2,a member of the FLO2 gene family, affects the enlargement of leaves at the vegetative stage and facilitates the regulation of carbon metabolism and flow

Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2020, 84 (12):2466-2475.

[本文引用: 1]

张大鹏. 稻米品质突变体库的构建及粉质胚乳垩白突变体(flo6)的基因定位. 杭州:浙江大学, 2012.

[本文引用: 1]

Nishi A, Nakamura Y, Tanaka N, et al.

Biochemical and genetic analysis of the effects of amylose-extender mutation in rice endosperm

Plant Physiology, 2001, 127(2):459-472.

[本文引用: 1]

Liabres S, Tsenkov M I, Macgowan S A, et al.

Disease related single point mutations alter the global dynamics of a tetratricopeptide (TPR) α-solenoid domain

Journal of Structural Biology, 2020, 209(1):107405.

[本文引用: 1]

Wei G, Yang H X, Xiong Z X, et al.

TPR domain coding gene ST2 may be involved in regulating tillering and fertility in rice

Czech Journal of Genetics and Plant Breeding, 2021, 57(3):83-90.

[本文引用: 1]

Myers A M, James M G, Lin Q, et al.

Maize opaque5 encodes monogalactosyldiacylglycerol synthase and specifically affects galactolipids necessary for amyloplast and chloroplast function

Plant Cell, 2011, 23(6):2331-2347.

[本文引用: 1]

Kelly A A, Kalisch B, Hölzl G, et al.

Synthesis and transfer of galactolipids in the chloroplast envelope membranes of Arabidopsis thaliana

Proceedings of the National Academy Science of the United States of America, 2016, 113(38):10714- 10719.

[本文引用: 1]

/