杂种优势利用是进一步提高作物单产的有效途径之一[1⇓⇓⇓-5]。小麦温光敏两系法具有无需保持系、恢复源广且制种程序简单的优点，已成为我国小麦杂种优势利用的主要途径[6⇓⇓-9]。两系杂交小麦品种在示范推广中表现出丰产、节水、抗旱和耐瘠等优势，尤其在中低产田，增产可达20%以上[10⇓-12]。对杂交种进行纯度鉴定是杂交种生产和应用中必不可少的环节[13]。常用的纯度鉴定方法是田间种植杂交种，抽穗后对植株表型进行检测，该方法鉴定时间长，且准确性易受环境影响[14⇓-16]。近年来，SSR标记已成功应用于核心种质基因型分析[17⇓-19]、小麦区域试验品系DUS测试[20⇓⇓-23]以及构建小麦DNA指纹图谱[24⇓-26]等。基于荧光标记SSR的毛细管电泳检测法可得到目标DNA片段的准确大小，具有稳定、准确和高效等特点，已广泛用于大批量品种的鉴定和指纹图谱检测分析[27⇓-29]。
为探索荧光标记SSR在温光敏两系杂交小麦杂交种纯度检测中应用的可行性，本研究对2个温光敏两系组合的杂交种采用田间种植表型鉴定和荧光标记SSR进行了纯度分析，比较2种方法的准确性，建立快速鉴定杂交种纯度的方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为小麦温光敏核不育系K64S、恢复系20Y4-5、组合K64S/20Y4-5和K64S/MR1238的杂交种，均由云南省农业科学院粮食作物研究所提供；恢复系MR1238由绵阳市农业科学研究院选育提供。不育系K64S、恢复系20Y4-5、组合K64S/20Y4-5和K64S/MR1238的杂交种均为春性品种，在昆明均可常年种植并正常抽穗；2个杂交种均来自1334m2（2亩）的小规模制种试验。
K64S、20Y4-5和MR1238在昆明常年种植的株高分别为60~65cm、75~80cm和90~95cm，杂交种的株高介于双亲之间。
1.2 试验方法
1.2.1 材料种植
试验材料于2021年5月21日播种于云南省农业科学院昆明嵩明试验基地，该地海拔1920m，春性小麦材料全年均可种植，并可正常抽穗收获。行长1.2m，采用点播，株行距10cm×25cm，每个杂交种播种1500粒，每20行种植1行父本和1行母本作为表型鉴定对照。
1.2.2 田间表型鉴定
因不育系与恢复系间株高差异明显，植株抽穗扬花后到成熟期，以株高结合穗部性状判断每个单株表型，与不育系相同记为“1”，与恢复系相同记为“2”，不同于双亲的记为“3”（即为杂交种）。
1.2.3 SSR标记基因型鉴定
基因组DNA提取：杂交种及其双亲生长到3叶期，从2个组合所有杂交种行区各随机选574个单株（加上2个亲本共计576个单株，96孔PCR仪刚好运行6次）挂牌编号、取叶片，同时取对应不育系、恢复系植株叶片，用植物基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取待检测样品基因组DNA；用Nanodrop one检测DNA浓度，用超纯水将DNA稀释为10ng/µL备用。取样的杂交种植株于抽穗后逐株记录表型纯度鉴定结果。
从行业标准《NY/T 3749-2020普通小麦品种纯度鉴定SSR分子标记法》推荐的10对引物中选取8对引物，筛选父母本间有多态性的引物，引物信息见表1。
表1 SSR标记引物序列
Table 1
| 引物名称Primer name | 染色体分布Chromosome location | 引物序列（5′-3′）The sequence of primer(5′-3′) |
|---|---|---|
| barc324 | 3A | F：CCAATTCTGCCCATAGGTGA R：GAGGAAATAAGATTCAGCCAACTG |
| barc164 | 3B | F：TGCAAACTAATCACCAGCGTAA R：CGCTTTCTAAAACTGTTCGGGATTTCTAA |
| cfa2028 | 7A | F：TGGGTATGAAAGGCTGAAGG R：ATCGCGACTATTCAACGCTT |
| cfa2123 | 7A | F：CGGTCTTTGTTTGCTCTAAACC R：ACCGGCCATCTATGATGAAG |
| gwm155 | 3A | F：CAATCATTTCCCCCTCCC R：AATCATTGGAAATCCATATGCC |
| gwm161 | 3D | F：GATCGAGTGATGGCAGATGG R：TGTGAATTACTTGGACGTGG |
| gwm304 | 5A | F：AGGAAACAGAAATATCGCGG R：AGGACTGTGGGGAATGAATG |
| gwm610 | 4A | F：AGGAAACAGAAATATCGCGG R：AGGACTGTGGGGAATGAATG |
荧光PCR扩增体系10μL，包括基因组DNA1μL、上、下游引物0.3μL、2×Taq PCR Master Mix5μL、超纯水补足至10μL。反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃~52℃退火30s，72℃延伸30s，运行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，运行25个循环；最后72℃延伸20min。然后上机检测，取3μL荧光PCR扩增产物，用2%琼脂糖凝胶电泳检测荧光PCR扩增条带是否正常，并参照标准DNA Marker将荧光PCR产物稀释至相同浓度，分别取每个稀释后的荧光PCR产物1μL加入7μL混有4‰Liz 500内标的去离子甲酰胺，上ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳检测。
用峰图分析软件GeneMarker 2.0读取荧光PCR扩增片段大小。
1.3 纯度鉴定
通过表型鉴定和基因型鉴定分别计算杂交种纯度。计算公式如下。
田间杂交种纯度（%）=表型为“3”的植株数/播种杂交种总株数×100；分子标记杂交种纯度（%）=父母本杂合带植株数/检测杂交种总株数×100。
1.4 数据处理
采用SPSS 21.0对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 田间表型纯度鉴定
组合K64S/MR1238和K64S/20Y4-5的杂交种分别播种1500粒，各出苗1467和1448株。不育系K64S平均株高62.3cm，变幅为61.2~63.1cm；恢复系MR1238平均株高88.6cm，变幅为87.8~90.2cm；恢复系20Y4-5平均株高75.6cm，变幅为74.3~76.9cm；K64S/MR1238杂交种平均株高74.7cm，变幅为62.5~88.9cm；K64S/20Y4-5杂交种平均株高69.3cm，变幅为62.4~74.4cm。2个杂交种与其双亲间株高均差异明显，以株高差异结合穗部性状对2个杂交种的纯度进行表型鉴定，结果见表2。
表2 杂交种株高表型鉴定
Table 2
| 杂交种 Hybrid | 鉴定株数 Number of tested plants | 表型“1”株数 Number of plants with phenotype “1” | 表型“2”株数 Number of plants with phenotype “2” | 表型“3”株数 Number of plants with phenotype “3” | 纯度 Purity (%) |
|---|---|---|---|---|---|
| K64S/MR1238 | 1467 | 8 | 9 | 1450 | 98.84 |
| K64S/20Y4-5 | 1448 | 23 | 7 | 1418 | 97.93 |
K64S/MR1238的杂交种中伪杂交种17株，其中8株为不育系，9株为恢复系MR1238，纯度为98.84%。
K64S/20Y4-5的杂交种中伪杂交种30株，包括23株自交不育系和7株恢复系，纯度为97.93%。
2.2 SSR标记筛选
表3 亲本间多态性引物筛选
Table 3
| 亲本Parent | barc164 | barc324 | cfa2028 | cfa2123 | gwm155 | gwm161 | gwm304 | gwm610 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 20Y4-5 | 211 | 258 | 275 | 270 | 165 | 192 | 222 | 189 |
| MR1238 | 199 | 264 | 277 | 270 | 147 | 195 | 222 | 189 |
| K64S | 208 | 264 | 277 | 270 | 147 | 174 | 222 | 193 |
图1
图1
3个亲本的多态性引物峰图
Fig.1
The peak spectrum of polymorphic primers of three parents
2.3 杂交种单株基因型检测
根据上述SSR引物筛选结果，选择引物barc164对2个杂交种进行纯度检测，并与对应表型鉴定结果进行比较（表4）。2个组合杂交种随机取样的574株表型鉴定纯度分别为98.43%和97.74%，对应的SSR标记检测纯度分别为97.73%和97.21%，经卡方检验两种纯度间差异不显著，χ2检测值分别为0.55（P=0.51）和0.62（P=0.49），说明分子标记鉴定与田间表型鉴定都可用于杂交种纯度鉴定，且两者间鉴定结果相近。574株杂交种田间表型检测纯度分别为98.43%和97.74%，全部1467株和1448株杂交种的表型鉴定纯度分别为98.84%和97.93%，经卡方检验两者间纯度差异不显著，χ2检测值分别为0.55（P=0.46）和0.07（P=0.79），说明随机取样的574株杂交种的表型检测纯度与全部1467株和1448株杂交种的表型鉴定纯度相同。
表4 574株杂交种的表型和标记鉴定纯度比较
Table 4
| 组合 Combination | 鉴定数 Number of tested plants | 表型“1” 株数 Number of plants with phenotype “1” | 表型“2” 株数 Number of plants with phenotype “2” | 表型“3” 株数 Number of plants with phenotype “3” | 表型纯度 Purity identifiedby phenotype (%) | 母本基因 型数量 Number of femaleparent genotypes | 父本基因 型数量 Number of male parent genotypes | 杂合基因型 Heterozygous genotype | 其他基因型 Number of other genotypes | 标记纯度 Purity identified by the marker(%) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| K64S/MR1238 | 574 | 4 | 5 | 565 | 98.43 | 4 | 5 | 561 | 4 | 97.73 |
| K64S/20Y4-5 | 574 | 9 | 4 | 561 | 97.74 | 9 | 4 | 558 | 3 | 97.21 |
组合K64S/20Y4-5的杂交种中有16株伪杂种，包括9株不育系、4株恢复系20Y4-5和3株其他基因型，其杂交种纯度为97.21%。3株伪杂种基因型为199bp/208bp杂合带型，20Y4-5的barc164带型为211bp，MR1238的barc164带型为199bp，该组合的杂交种出现199bp/208bp杂合带型的原因可能是制种中与上一组合的父本MR1238发生“串粉”，因2个组合试制种时相邻种植，用吹风机辅助授粉时，少量MR1238花粉越过隔离布与邻田不育系K64S授粉，导致K64S/20Y4-5杂交种中出现199bp/208bp带型的杂交种。
3 讨论
温光敏两系法杂交种的纯度受恢复系纯度、不育系纯度和制种环境温光条件的影响。杂交种纯度直接影响杂种优势的表现，种子纯度每下降1个百分点可直接导致作物减产约1%[30]，而且纯度不达标的杂交种不能进入市场销售。因此，杂交种在种子加工前必须进行纯度检测。
传统的杂交种田间种植表型纯度检测法，需在异地或异季耗时一个生长季节（3~4个月），如果双亲与杂交种间表型差异较小，还会影响鉴定结果的准确度。SSR荧光标记毛细管电泳技术能够检测2bp差异，分辨率较传统银染高[31⇓⇓-34]，本研究中也获得相同结果，引物cfa2028在父本20Y4-5和母本K64S间扩增出275bp和277bp片段，因此能精准鉴定杂交种在该位点的来源。此外，本研究筛选出3个标记barc164、gwm161、gwm610可用于优势组合K64S/MR1238和K64S/20Y4-5的杂交种纯度检测，其中barc164和gwm161标记较好；不同杂交组合可能有不同的纯度检测分子标记，需另行筛选确定。
分子标记利用种子即可进行基因型鉴定，进行纯度估算。小麦温光敏两系杂交种分子标记检测纯度鲜有研究。为验证分子标记检测的适用性，本研究利用田间苗期取样，表型与基因型相互对应，从而使表型鉴定与标记鉴定为同一材料，降低因材料不同而产生的随机误差。
本研究中2个组合K64S/MR1238和K64S/20Y4-5杂交种的SSR标记检测纯度（97.73%和97.21%）略低于田间表型鉴定纯度（98.84%和97.93%），与匡猛等[35]和李倩等[36]在棉花和茄子杂交种的纯度检测结果一致，差异原因与2种方法对伪杂种的区分程度有关。本研究中伪杂种来自小麦温光敏不育系自交结实和父本的机械混杂或生物学混杂，SSR荧光标记分析发现K64S/20Y4-5杂交种中有3株为母本K64S与邻田父本MR1238花粉“串粉”产生的杂交种，虽然正季种植时2个组合的杂交种株高相差约5cm，但在本次夏播田间种植表型鉴定中未能区分出来，加之2个组合为同一母本，对表型鉴定有干扰，这也显示了分子标记检测纯度的优点。同一品种或组合，在异季、异地种植时其表型与正季种植相比有一定差异，进而影响纯度鉴定结果。
本研究同时用田间种植表型鉴定和SSR荧光标记2种方法对2个温光敏两系杂交小麦杂交种的纯度进行了测定，2种方法的纯度鉴定结果在2个组合上都高度一致，无明显差异，证明SSR荧光标记不仅能准确检测小麦杂交种纯度，还能进一步鉴定伪杂种的来源，为制种中的防杂保纯提供参考依据，因此可以替代田间种植表型鉴定法。同时该检测方法7d内即可获得纯度结果，为后续种子加工、销售或新组合参加各种试验提供了充足时间。
在利用SSR荧光标记进行小麦杂交种纯度检测中，检测样本大小无疑对结果的准确性有影响。本研究中用于标记分析的样本数约占田间种植总株数的1/3（574株），准确鉴定纯度所需最少样本数还需进一步研究确定。
4 结论
通过田间种植表型鉴定和标记基因型鉴定对2个小麦温光敏两系杂交种纯度进行鉴定，发现分子标记鉴定不仅可区分杂交种中恢复系和不育系混杂，还可以区分其他恢复系花粉“串粉”等造成的伪杂种，且检测周期短，可替代田间种植表型鉴定法。
参考文献
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Trials for hybrid seed production and estimation of wheat F1 hybrids produced by outcrossing using photoperiod-sensitive cytoplasmic male sterile (PCMS) system with elite lines
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光照强度对温光敏细胞核雄性不育小麦育性的影响
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以具有低温不育、高温可育特性的温光敏细胞核雄性不育小麦C412S和C404S为材料，以其回交转育亲本、育性正常的C412和C404为对照，用人工气候箱研究了光照强度对温光敏细胞核雄性不育小麦育性表达的影响。结果表明，在低温条件下（日温8℃/夜温6℃），C412S和C404S在不同光照强度（160 μmol /m2 ·s和300 μmol /m2 ·s）下自交结实率都为0%，表现为完全不育。在较高温度条件下(日温18℃/夜温14℃) ，从花粉母细胞形成期到开花期的光照处理，C412S在160 μmol /m2· s弱光照下的自交结实率仅为5.4%，表现为高不育，在300 μmol /m2· s较强光照下的自交结实率高达65.0%，表现为高度可育；而另一不育系C404S在两种光照强度下的自交结实率分别为69.9%和73.2%，都达到了高度可育水平。表明光照强度对温光敏细胞核雄性不育小麦的雄性育性表达具有重要影响，但不同材料对光照强度的响应程度有所差异。
中国西南温光型两系杂交小麦研究进展
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为深入西南温光型两系杂交小麦研究，综述了中国西南温光型两系杂交小麦研究历程，包括温光型不育系的发现和温光型两系杂交小麦研究的起始，温光型不育系育性稳定性研究，生理变化，温光条件对育性的影响，外源化学物质对‘C49S’育性的影响；总结了应用研究成果，包括对原始温光型不育系的改造，恢复系的选育，温光型两系杂交小麦强优势组合筛选，中国西南温光型两系杂交小麦配套栽培技术研究及其生产示范；提出了西南温光型两系杂交小麦研究中存在的问题：（1）对条锈病抗性的丧失影响杂交小麦的应用，（2）如何提高制种纯度的问题，（3）如何降低制种成本的问题。文章最后介绍了西南温光型两系杂交小麦研究的新动向，提出了应对方法。
Unlocking big data doubled the accuracy in predicting the grain yield in hybrid wheat
Marker assisted evaluation of fusarium head blight resistant wheat germplasm
中国小麦微核心种质及地方品种籽粒休眠特性的分子标记鉴定
DOI:10.3724/SP.J.1006.2010.01649
[本文引用: 1]
为探索我国小麦微核心种质及地方品种籽粒休眠的遗传基础，利用已报道的4个3AS上的SSR标记(Xbarc57、Xbarc294、Xbarc310和Xbarc321)和1个3BL上的Viviparous-1基因标记Vp1-b2对107份我国小麦微核心种质及31份地方品种进行籽粒休眠的分子标记鉴定。结果表明，5个分子标记在试验材料中表现出丰富的等位变异，具有5~6种等位类型，与籽粒萌芽指数(GI)密切相关。根据一般线性模型分析结果，各位点的等位变异显著影响籽粒休眠，其中Vp1-b2和Xbarc294对籽粒休眠作用较其他标记大，可分别解释65.8%和61.2% 的表型变异；其次是Xbarc310 (56.3%)和Xbarc57 (55.8%)，最小的是Xbarc294(53.3%)。而5个标记联合可解释95.9% 的性状变异，其次是Vp1-b2和Xbarc294的组合(89.1%)，解释变异最小的标记组合是 Vp1-b2和Xbarc321 (79.4%)。5个分子标记即可解释籽粒休眠的绝大部分表型变异，说明我国小麦微核心种质及地方品种籽粒休眠特性受3AS和3BL上的2个主效基因控制。
Utilization of SSR and AFLP markers for the assessment of distinctness in durum wheat
DOI:10.1007/s11032-008-9176-4 URL [本文引用: 1]
小麦指纹图谱数据库的建立及SSR分子标记试剂盒的研发
本研究以国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）、国际干旱地区农业研究中心（ICARDA）、法国Agropolis研究所和中国农业科学院作物科学研究所提供的数据为基础，建立了包括134个SSR引物、2457个普通小麦基因型的指纹图谱数据库。利用荧光标记法的分析结果，用代表性基因型在某一位点的扩增片段作为银染法的读带依据，开发了SSR分子标记试剂盒，包括46对SSR引物及其PCR反应程序、代表性基因型的DNA样品、592个等位变异的代表性基因型清单及试剂盒使用说明等。该数据库的建立和试剂盒的开发，为利用SSR分子标记技术进行小麦种质遗传多样性研究，实现小麦遗传资源和信息资源全球共享提供了重要工具和技术平台。
Fingerprinting and identification of closely related wheat (Triticum aestivum L.) cultivars using ISSR and fluorescence-labeled TP-M13-SSR markers
基于SSR标记的山东省小麦DNA指纹图谱的构建
DOI:10.13430/j.cnki.jpgr.2013.03.025
[本文引用: 1]
本文以山东省41份小麦种质资源为材料，使用46对引物，通过SSR技术对其进行了DNA指纹数据库的构建。结果显示，所采用的46对引物在本实验材料中共检测到69个等位基因，有较好的多态性。利用NTSYS进行UPGMA聚类分析后，发现这41种材料在遗传相似系数0.68为阀值处可以分为3个类群。实验证明该方法能够分辨各个种质间的亲缘关系，能够较好满足小麦DNA指纹数据库的构建要求，对山东省小麦遗传资源的收集、保存、分类、评价、核心种质的建立等研究工作提供理论依据。
基于荧光检测技术的小麦品种SSR鉴定体系的建立
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.001
[本文引用: 1]
【目的】建立基于SSR荧光标记的小麦品种DNA指纹鉴定体系，为中国小麦育成品种鉴定提供高通量技术手段。【方法】收集已定位到小麦21条染色体上的SSR标记引物，通过PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术，筛选在中国小麦育成品种中多态性高的标记，对筛选出的引物5′末端利用6-FAM、HEX、ROX和TAMRA 4种荧光染料之一进行标记,利用DNA分析仪对扩增产物的峰型进行评价并检测不同等位变异的扩增片段大小，选择峰型简单易读、多态性高、较均匀分布到21条染色体上的标记，确定不同位点等位变异的大小及相应的参照品种，建立基于荧光SSR标记的高通量小麦品种鉴定体系。【结果】利用2 438对SSR标记对8份植物学性状差异大的小麦育成品种进行初步筛选，共筛选出260对多态性较高、扩增稳定的SSR引物。利用上述260对引物对48份小麦品种继续进行复筛，选出130对扩增稳定、多态性高、带型好的SSR引物。对这些引物的正向5′末端分别标记6-FAM、HEX、ROX和TAMRA荧光后，利用DNA分析仪进行检测评价，最终选择了42个PCR扩增稳定、峰图简单、多态性高、连锁群分布均匀的SSR荧光标记。根据DNA分析仪检测到的每个标记的不同等位变异大小，为相应位点的不同等位变异进行了命名，并为每个等位变异选取了相应参照品种。根据每个引物标记的荧光和扩增的片段大小范围对42对引物进行合理搭配，在同一毛细管内对多个荧光标记进行检测，提高了DNA指纹数据采集效率,降低了检测成本。利用该体系对1 625份小麦育成品种进行DNA指纹数据采集，在42个位点中共检测到434个等位变异，每个位点的等位变异个数在3—23，平均10.3个；每个位点的PIC值范围为0.240—0.829，平均0.610。利用1 625份小麦育成品种DNA指纹数据,构建了中国小麦育成品种的DNA指纹数据库。【结论】筛选出42对SSR标记引物，建立了基于荧光SSR标记的小麦品种鉴定体系，可用于高通量小麦品种DNA指纹鉴定。
玉米品种SSR标记毛细管电泳荧光检测法与变性PAGE银染检测法的比较研究
DOI:10.3321/j.issn:1000-7091.2006.05.016
[本文引用: 1]
以192份玉米品种为材料，用7对SSR引物对毛细管电泳荧光检测和常规的变性PAGE银染检测两种SSR标记检测方法进行比较分析。结果表明，两种方法检测的SSR标记片段大小一致。毛细管电泳荧光检测法检测的结果更为精确、灵敏、高效，更适用于高通量材料的检测分析。对少量材料进行检测分析以及SSR标记的筛选时，使用常规的变性PAGE银染检测法更经济适用。
不同SSR标记检测技术及其在花生栽培种遗传多样性分析中的应用
DOI:10.13430/j.cnki.jpgr.2014.01.013
[本文引用: 1]
以85份花生栽培种为材料，分别应用银染法和荧光检测法检测9对SSR引物的扩增产物。比较结果显示，荧光检测法具有灵敏度高、检测结果准确、效率高等优点。聚类分析表明，银染法与荧光检测法分别能够区分74个和82个花生品种,并分别聚成8和9个类群；荧光检测法的聚类结果虽然反映的品种间遗传多样性较低，但与品种类型、产地及其亲缘关系相关程度更高，表明荧光检测数据更精确、可靠。遗传多样性分析发现，地方品种的遗传多样性指数最高，其次为多粒型育成品种，表明我国地方品种和多粒型育成品种蕴藏了丰富的优异性状，有利于对其挖掘和利用。
棉花杂交种纯度的SSR标记检测及其与田间表型鉴定的相关性
DOI:10.3724/SP.J.1006.2011.02299
[本文引用: 1]
以分布于棉花26条染色体的36对SSR核心引物，在6份成套中棉所系列杂交种间筛选双亲互补型杂合位点作为纯度检测标记, 采用单位点平均法与双位点差异法统计SSR标记检测结果; 在棉铃期考察棉花株型、铃形、叶形、花及茎等性状, 比对田间表型与分子检测结果, 分析相关性。结果表明, 34对核心引物在6个杂交种上获得101个杂合位点，平均每个杂交种具有16.8个。田间表型鉴定结果高于分子标记检测结果，单位点平均法的相关性高于双位点差异法，校正后的相关性进一步提高，相关系数r=0.7841，呈高度相关。EST-SSR标记的检测结果与田间表型鉴定结果的相关性显著高于Genomic-SSR标记。相同染色体上的不同引物检测结果差异较小。不同的统计方法与标记类型获得的分子标记检测结果差异较大。高度纯合的亲本将会有效提高分子标记鉴定结果与表型鉴定结果的相关性。
