烤烟是我国重要的经济作物之一，同时也是对土壤比较敏感的作物。在烟草种植过程中，长期大量使用化肥和有机肥施用比重较低等问题导致土壤质量下降，进而使烤烟生长发育受阻^[1⇓⇓-4]，导致烤烟烟叶产量和品质下降^[5⇓-7]，这是烤烟生产亟待解决的问题。近年来，土壤健康问题备受大众关注，微生物菌剂中的植物根系促生菌（plant growth- promoting rhizobacteria，PGPR）能够有效恢复土壤微生态，提高土壤生物多样性与酶活性^[8-9]，同时使土壤难溶性矿物养分得到分解和释放，并产生大量植物生长激素，刺激植物生长^[10]。黄光祥等^[11]研究表明，施用微生物菌剂可以显著降低黑胫病的发病率，还能提升土壤中的生物活性和养分利用率，进而促进烤烟的生长和发育，同时也可增强植株的抗性能力。有关报道^[12]称，PGPR在根际土壤中的定殖能力强弱是微生物菌剂在应用中发挥生防和促生效果的关键因素，而根际土壤环境对促生菌的定殖效果影响尤为明显。目前，选择微生物菌剂施用时期主要在起垄期到旺长期，但这一生育阶段烟株根际土壤环境的变化十分明显^[13-14]。目前，对微生物菌剂最适宜施用时期相关研究报道甚少。同时对施用微生物菌剂后土壤微生物与烤烟产量和质量之间关系缺少深入的研究。本文以广西百色烟区为例，探究不同时期施用微生物菌剂对烤烟产量和品质的影响，分析土壤微生物群落与烤烟产量和质量之间的关系，为烤烟生产上合理使用微生物菌剂提供参考。

试验于2022年在广西百色靖西同德乡果老村开展，试验地点选择在产区常年土传病害发生较为严重的烟田，前茬作物为水稻。供试烤烟品种为当地的主栽品种K326。微生物菌剂是购于北京恩格兰环境技术有限公司的烟草专用微生物菌剂，有效活菌数≥30.0亿/g，其中解淀粉芽孢杆菌≥15.0亿/g、枯草芽孢杆菌≥5.0亿/g、巨大芽孢杆菌≥2.0亿/g、其他有益抗病菌≥8.0亿/g。烟株移栽前土壤全钾11.49 g/kg、全氮2.58 g/kg、全磷1.65 g/kg、有机质19.11 g/kg、速效钾227.09 mg/kg、速效氮90.60 mg/kg、速效磷14.08 mg/kg、pH 7.03。

设置微生物菌剂施用时期（A）单因素试验。A1：起垄时施用，A2：移栽时施用，A3：团棵期施用，CK：不施用微生物菌剂。各处理微生物菌剂施用量固定为60 kg/hm²。起垄时与有机肥拌匀条施，移栽、团棵期均采用水溶浇施。各处理3次重复，每小区植烟70株。施肥措施及田间管理参照当地主栽大田，并按照精细化烘烤技术要求采烤。

采用五点取样法，在烤烟的成熟期（移栽后90 d）采集每个小区烟株的根际土壤，混匀成一个样品后装入无菌管并于-4 ℃低温保存，用于测定酶活性。使用Solarbio酶活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）测定多酚氧化酶、蔗糖酶、过氧化氢酶以及脲酶活性。

采用五点取样法，在烤烟的成熟期（移栽后90 d）采集每个小区烟株的根际土壤，混匀成一个样品后装入无菌管并于-4 ℃低温保存。使用E.Z.N.A土壤DNA试剂盒（D4015，Omega）按照说明书从新鲜土壤样品中提取DNA。对于土壤中的细菌多样性分析，选择细菌多样性鉴定区域16S V3-V4（前端引物：343F- TACGGRAGGCAGCAG，后端引物：798R-AGGG TATCTAATCCT）进行2轮PCR扩增后得到原始数据；而真菌多样性则选择前端引物：ITS1F-5'-CTTG GTCATTTAGAGGAAGTAA-3'；后端引物：ITS2R- 5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'进行2轮扩增得到原始数据。采用Trimmomatic软件对原始序列的两端去杂后，利用FLASH软件进行拼接，再采用Vsearch软件根据序列相似性将序列归为多个OTU分类操作单元，通过QIIME软件挑选出各个OTU的代表序列，并将所有代表序列与数据库进行比对注释。

分别于中部叶成熟期调查每小区青枯病的发病情况，并计算发病率、病情指数及相对防治效果，烤烟土传病害发生情况按照烟草病虫害分级及调查方法（GB/T 23222-2008）^[15]进行。

烤后烟叶按烤烟分级标准（GB 2635-1992）^[16]进行分级后，每个小区各取C3F等级烟叶，于60 ℃恒温烘干后粉碎过80目筛，用于测定常规质量指标。依据YC/T 159- 2019^[17]测定烤烟总糖和还原糖含量，依据YC/T 216-2013^[18]测定淀粉含量，根据YC/T 160-2002^[19]测定烟碱含量，依据YC/T 161-2002^[20]测定总氮含量，根据YC/T 274-2008^[21]测定钾离子含量，依据YC/T 176-2003^[22]测定石油醚含量。

按小区挂牌烘烤，初烤烟叶下秆后，按烤烟分级标准（GB 2635-1992）^[16]对烟叶进行分级，依据当地当年烤烟收购价格统计其产量、产值、均价和上等烟比例，单位面积产量和产值由小区数据折算。

运用Excel 2019和SPSS 26对试验数据进行处理。使用MEGA 11对送检获取到的OTU序列进行聚类分析，在绘图网站（http://www.evolgenius. info/）构建OTU进化树。在R语言4.2.2软件中的igraph、dplyr、linkET和ggplot2包^[23-24]中进行细菌共生可视化网络和Mantel检验分析及可视化。

如表1所示，不同时期施用微生物菌剂对多酚氧化酶、蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶活性均有一定的影响，均表现为CK各种土壤酶活性最低。多酚氧化酶活性A2最高，A1、A2和A3相较于CK分别显著提高了12.42%、17.60%和10.34%；蔗糖酶活性A2最高，A1、A2和A3相较于CK分别显著提高6.84%、16.49%和7.42%；脲酶活性A2最高，A1、A2和A3相较于CK分别显著提高了13.01%、44.32%和19.07%；过氧化氢酶活性A2最高，A1、A2和A3显著高于CK，分别增加了37.60%、68.32%和48.92%；以上结果分析表明，施加微生物菌剂能够提高植烟的土壤酶活性，但不同施用时期对土壤酶的活性影响有一定差异。

不同时期施用微生物菌剂土壤微生物的Alpha多样性指数分析结果见表2，不同处理根际土壤样品中微生物的物种覆盖度（goods coverage，代表测序深度）均为80%以上，表明样品中的序列绝大多数被测出。A2和A3处理烤烟根际土壤中细菌的物种数显著高于CK和A1；烤烟根际中细菌的Chao1指数以A2最高，其次为A3，两者均显著高于A1和CK；A2处理的土壤细菌香农指数（Shannon）和辛普森指数（Simpson）均最高，并且显著高于其他处理。以上结果表明，在移栽期施加微生物菌剂能够显著提高烤烟根际中细菌微生物的多样性。

由OTU构建的系统发生进化树（图1）显示，在属水平上丰度排前100的细菌属于变形菌门（Proteobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、埃普西隆杆菌门（Epsilonbacteraeota）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和梭杆菌门（Fusobacteria）。其中CK中有6个差异显著的细菌属，分别是变形菌门中的Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Lautropia、Ramlibacter、Stenotrophomonas和Thioalkalispira，以及放线菌门中的Arthrobacter；A1处理有8个差异显著的细菌属，分别为变形菌门的Ideonella、Ellin6067、Pseudomonas和Rhodoplanes，放线菌门中的Promicromonospora和Jatrophihabitans，拟杆菌门中的Parafilimonas和Chitinophaga；A2处理有5个差异显著的细菌属，分别为变形菌门Duganella、Sphingopxis和Hyphomicrobium，放线菌门的Mycobacterium，埃普西隆杆菌门的Leptotrichia；A3处理中有4个差异显著的细菌属，分别为变形菌门的Neisseria和Sphaerotilus，以及拟杆菌门的Alloprevotella和Prevotella_7。

图2为门水平相对丰度排名前15的细菌群落构成情况。门水平相对丰度达到1%以上的优势细菌门有6种，各处理的变形菌门相对丰度均最高，为48.95%⁓ 52.69%，其中A2处理的最高；其次为放线菌门，为10.70%⁓14.56%，其中A2处理的最高；拟杆菌门相对丰度为10.09%⁓12.40%，其中A2处理的最高；厚壁菌门相对丰度为5.20%⁓8.47%，其中A2处理的最高；芽孢单胞菌门相对丰度为5.56%⁓7.26%，其中A2处理的最高；酸杆菌门相对丰度为2.57%⁓ 10.77%，其中CK处理的最高。以上结果证明，施加微生物菌剂以及在不同时期施加微生物菌剂均对烤烟根际土壤细菌群落有较明显的影响。

如图3所示，在门水平下，不同处理聚类为2个大类3个亚类。聚类分析结果所示，CK与变形菌门、硝化螺旋菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、放线菌门、纤维杆菌门和绿弯菌门的细菌相对丰度呈极显著负相关；与梭杆菌门、螺旋菌门、纤维杆菌门、酸杆菌门、髌骨菌门、埃普西隆杆菌门、疣微菌门和其他菌门的细菌相对丰度呈极显著正相关。A2与变形菌门、硝化螺旋菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、放线菌门、纤维菌门和绿弯菌门的细菌相对丰度呈显著正相关；与梭杆菌门的细菌相对丰度呈极显著负相关，并与酸杆菌门、髌骨菌门的细菌相对丰度呈显著负相关。

如图4所示，通过构建不同处理的土壤细菌共生网络，进而分析不同时期施加微生物菌剂对烤烟根际土壤细菌群落的关联性。细菌共生网络的节点包括11种，分别为变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、疣微菌门、梭杆菌门、暂定菌门和未知菌门。

平均度在细菌共生网络中代表了网络中所有节点的平均加权度，而平均聚类系数在细菌共生网络是用于衡量网络中节点之间联系的紧密程度。由图5可知，各处理均形成了独特的细菌共生网络，其中A2处理构成的细菌共生网络最为复杂，其次是A1处理。A2细菌共生网络的平均度为12.750，平均聚类系数为0.736，均最高，边数为204，最多。为量化处理间细菌共生网络的差异性，计算CK、A1、A2和A3网络的共同边和唯一边数，比较得出2个处理的共同边较少，而每个处理都有许多独特的边。CK和A1的网络共享23条边，与A2的网络共享25条边，与A3的网络共享28条边，A1和A2的网络共享68条边，A1和A3共享50条边，A2和A3的网络共享39条边。其中CK网络包含77条正相关的边和64条负相关的边，A1网络包含107条正相关的边和88条负相关的边，A2网络包含107条正相关的边和97条负相关的边，A3网络包含102条正相关网络和97条负相关的边。

综上分析可知，A2处理的属水平细菌共生网络最为复杂，其属水平细菌群落间的关联性最为密切，细菌群落间相互影响的作用最强。

如表3所示，烟草青枯病发病率和病情指数的变幅分别为19.02%⁓66.91%和11.16%⁓38.27%，施加微生物菌剂的处理发病率和病情指数均显著低于CK，其中A2处理的发病率与病情指数均显著低于A1、A3和CK。相对防治效果的变幅为47.25%⁓70.82%，A2处理的相对防治效果最佳，并且显著高于A1和A3处理。以上结果表明，施加微生物菌剂能抑制烤烟青枯病的发生，其中A2处理对烟草青枯病的防治效果最佳。

如表4所示，烤烟总氮含量在1.53%⁓2.13%，其中A2处理总氮含量最高，CK总氮含量最低，A1、A2和A3处理相较于CK分别显著提高21.57%、39.22%和32.03%。各处理钾含量变幅在2.18%⁓2.90%，其中A3处理钾含量最高，A1、A2和A3处理钾含量较CK分别显著提高32.57%、32.11%和33.03%。各处理烟碱含量变幅在1.82%⁓ 2.48%，其中A2处理的烟碱含量最高，A2和A3相较于CK分别显著提高36.26%和35.16%。各处理的还原糖和总糖含量变幅分别在14.83%⁓ 20.09%和21.60%⁓26.18%，其中A3处理的还原糖和总糖含量均最高，施加微生物菌剂处理的还原糖和总糖含量均显著高于CK。不同处理的两糖差变幅在5.80%⁓6.77%，其中CK的两糖差均显著高于施加微生物菌剂的处理。各处理的氮碱比和糖碱比变幅在0.83⁓0.86和10.37⁓11.90。综上各烤烟常规化学成分，A2处理的化学成分协调性最佳。

烤烟经济性状如表5所示，烤烟产量变幅在1929.51⁓2491.82 kg/hm²，其中A2处理产量最高，并且相较于CK、A1和A3处理分别显著提高29.14%、12.58%和5.50%。各处理烤烟产值在51 031.92⁓84 118.96元/hm²，其中A2处理产值最高，并相较于CK、A1和A3处理分别显著提高64.84%、29.21%和12.22%。各处理烤烟均价变幅在26.44⁓33.76元/kg，其中A2处理均价最高，相较于CK、A1和A3处理分别显著提高27.71%、14.81%和6.37%。各处理烤烟上等烟比例变幅在35.87%⁓56.82%，其中A2处理上等烟比例最高，相较于CK、A1和A3处理分别显著提高58.41%、32.05%和21.18%。烤烟中等烟比例变幅在39.95%⁓ 44.03%，其中A3处理中等烟比例最高，A2中等烟比例最低。综上烤烟各经济性状，A2处理的产量、产值、均价和上等烟比例均最高，并且均显著高于CK、A1和A3处理，因此认为A2处理的经济效益最佳。

Mantel检验分析（图6）表明，相较于其他施加微生物菌剂的处理，CK的根际细菌构成组分与根际土壤蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶活性、烟叶总氮含量、烤烟的产量、产值、均价和上等烟比例具有极显著的相关性。A1处理的根际细菌构成组分与根际土壤脲酶和过氧化氢酶活性、烟叶总氮含量以及烤烟产量、产值、均价和上等烟比例具显著相关性。A2处理的根际细菌构成组分与根际土壤多酚氧化酶、蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶活性、青枯病发病率和病情指数、烤烟产量、产值、均价和上等烟比例具有极显著的相关性；此外，还与根际土壤脲酶和过氧化氢酶活性、烤烟产量、产值、均价和上等烟比例具有显著相关性。A3处理的根际细菌构成组分与根际土壤多酚氧化酶、青枯病发病率和病情指数、烟叶总氮和还原糖含量、烤烟产量、产值、均价和上等烟比例具有极显著相关性。综合上述结果，土壤酶活性、青枯病发病情况、烤烟品质和产量、质量各方面变量与A2处理的细菌群落结构呈极显著相关性的最多，共有10项变量与其具有极显著相关性，因此认为A2处理的细菌群落结构与上述各方面指标的联系最为密切。从各方面变量的相关性而言，各处理的根际细菌群落构成与土壤酶活性和烤烟经济性状的相关性更强。

植物、根际微生物和环境因子三者构成一个彼此依赖、互相调控和相互限制的完整体系^[25-26]。前人^[27-28]在药用植物的研究表明，根系的微生物直接或间接地影响植物的生长发育和品质形成。本试验表明，与CK相比，施加微生物菌剂能够明显提高烤烟根际细菌群落数目，其中以移栽期施加微生物菌剂对细菌群落数目的增加最为明显，并且其Chao1、Shannon和Simpson指数均显著高于其他时期，说明在移栽期施加微生物菌剂能够增加烤烟根际细菌群落的多样性，同时还能提高优势菌群的优势地位。

从烤烟根际土壤的细菌群落构成而言，其优势细菌主要为变形菌门、芽单胞菌门、酸杆菌门、疣微菌门、硝化螺旋菌门、放线菌门、厚壁菌门、埃普西隆杆菌门、拟杆菌门和梭杆菌门共10个门。施加微生物菌剂的细菌群落构成与CK对比，变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和芽单胞菌门的相对丰度均有明显的增加，而酸杆菌门的相对丰度明显降低。其中在移栽期施加微生物菌剂变形菌门和厚壁菌门的细菌相对丰度最高，起垄期施加微生物菌剂放线菌门的细菌相对丰度最高。这是由于变形菌门属于富营养细菌，厚壁菌门和放线菌门均是富营养的微环境中自由生活型微生物群落的重要组成部分^[29]，在养分充足的条件下迅速生长。酸杆菌门是寡营养细菌，可以作为较贫瘠土壤环境的指示^[30]，用于判断土壤肥力的高低^[31]，由此可认为，施加微生物菌剂使土壤肥力得以改善。

施加微生物菌剂处理的烤烟青枯病发病率和病情指数均显著低于对照组，并且在移栽期施用微生物菌剂的发病率和病情指数均显著低于其他时期。周慕邱等^[32]研究表明，拟杆菌门的一些细菌能够产生多种多肽类氨基酸类抗生素，能够显著抑制大多数真菌病原菌的生长；厚壁菌门细菌产生的芽孢具有极强的抗逆性，能有效抵御外界的有害因子。此外，芽单胞菌门中含有很多潜在的生防菌，田程等^[33]研究表明，土壤中有芽单胞菌属的相对丰度，能有效抑制西瓜枯萎病的发病，与本研究结果类似。有关报道^[34-35]称，芽单胞菌属主要存在于抗病性较强的植株根际土壤中。

从土壤酶活性的影响而言，微生物菌剂的施用对烤烟根际土壤酶活性均有一定的提高，具体表现为施加微生物菌剂对烤烟根际土壤的多酚氧化酶、蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶活性均有明显的效果。其中，移栽期施用微生物菌剂对多酚氧化酶、蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶活性提高最为显著。Wang等^[36]研究表明，土壤酶的主要来源包括土壤微生物、动植物以及残体分泌物。值得注意的是，土壤微生物中的细菌在土壤酶的起源中占据重要地位，这进一步明确了土壤酶活性与细菌群落之间存在直接而复杂的关联^[37]。因此，本研究基于Mental检验（图6）分析土壤细菌群落与土壤酶活性之间的关系得出，移栽期施加微生物菌剂与土壤多酚氧化酶、蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶活性极显著相关，这可能是烟苗移栽后进入伸根期，根系活动较为活跃，在移栽期施加微生物菌剂更有助于建立有益微生物与植物根际共生的关系，提高根际酶的活性。

从烤烟产量和质量而言，施用微生物菌剂在一定程度上提高了烟叶的化学协调性，尤其表现为两糖差相比对照组显著降低。并且施加微生物菌剂使烤烟中部叶的钾含量、总糖、还原糖、总氮、烟碱、氮碱比和糖碱比更符合优质烟叶的生产要求。相较于其他处理，移栽期施用微生物菌剂处理的烤烟产量、产值、均价和上等烟比例均最高。综合而言，以移栽期施加微生物菌剂的中部叶化学协调性最佳，烤烟经济性状最优。

综上分析表明，施加微生物菌剂可提高烤烟根际微生物数量，增强土壤酶活性，促进细菌生长繁殖，改善土壤细菌种群结构。尤其在移栽期施加微生物菌剂对烤烟根际土壤酶活性的提高，其烤烟根际细菌群落构成更适宜烟叶品质和产量的形成，并且该处理能够有效抑制烟草青枯病的发生。因此，在烤烟生产上推荐在移栽期施加微生物菌剂。