化肥是现代农业生产中的重要投入品，对中国粮食产量的贡献率达56.8%^[1]，但我国农业生产特别是蔬菜生产中的化肥施用量已远超世界平均水平。据报道^[2]，中国蔬菜化肥的年施用量为1092 kg/hm²，是其他作物平均施用量的3.3倍。化肥的过度施用不但增加生产成本，还会导致土壤板结、水体污染和土壤生物多样性下降等一系列环境问题^[3]。因此开发环境友好和绿色高效的新型肥料已成为现代农业可持续发展的关键问题。植物根际促生细菌（plant growth promoted rhizobacteria，PGPR）是一类具有固氮、溶解磷酸盐、分泌吲哚乙酸、铁载体、细胞分裂素等功能的有益促生菌，其中芽孢杆菌是目前农业生产应用中最为广泛的促生菌^[4]。已有大量研究表明，PGPR可以通过提高土壤矿质养分的生物有效性^[5]、增强植株对生物（土壤病原菌、害虫）和非生物胁迫（重金属、干旱）的耐受能力^[6-7]以及分泌植物激素（如吲哚乙酸）、细胞分裂素^[8-9]来提高农业生产力。然而，外源促生细菌在被引入土壤时普遍会受到环境胁迫或本土微生物的竞争而导致其存活率低，对作物的促生效果不佳^[10-11]，因此为菌株选择一种生物友好、可持续获取的载体至关重要。生物炭作为一种多孔碳质材料，具有良好的吸附性与化学稳定性，已有研究^[12-13]表明使用生物炭吸附微生物可有效帮助菌株在土壤中定殖和发挥效用，但目前对微生物联合生物炭的研究主要集中于污染水体和土壤修复方面，而对土壤养分含量及细菌群落的影响缺乏研究。基于此，本试验以具有分泌吲哚乙酸（IAA）、铁载体及固氮功能的特基拉芽孢杆菌为材料，使用吸附法制备耦合特基拉芽孢杆菌的生物炭，以单施菌液和生物炭为对照，研究生物炭耦合特基拉芽孢杆菌对小白菜根际土壤养分及细菌群落结构的影响，明确其对土壤肥力的提升效果及根际调控机制，为新型炭基生物菌肥的生产应用提供理论与技术支持。

供试菌种为特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis，BT），分离于西沙岛礁土壤，经鉴定该菌株具有固氮、产IAA、产铁载体能力；供试小白菜品种（Brassica rapa L.）为上海青，购自河北省泊头市永红种子有限公司；生物炭购自浙江艾绿化工科技有限公司，小麦秸秆经马弗炉500 ℃厌氧裂解2 h，粉碎过2 mm筛后备用；供试土壤采自中国热带农业科学院湛江试验站综合试验基地农田耕作层土壤，风干后碾碎过2 mm筛网备用，基本理化性质为pH 5.48、有机质23 g/kg、碱解氮99.6 mg/kg、有效磷31 mg/kg、速效钾161 mg/kg、阳离子交换量6.1 cmol⁺/kg。供试培养基为LB培养基与发酵培养基。

菌液的制备：首先挑取特基拉芽孢杆菌单菌落于LB培养基中，于38 ℃下180转/min活化培养6 h，然后吸取活化好的菌液以1%接种量接入发酵培养基，在38 ℃下180转/min扩大培养48 h，过滤获得浓度为4×10⁹ CFU/mL的菌液备用。

特基拉芽孢杆菌耦合生物炭的制备：称取100 g灭菌生物炭于1 L锥形瓶中，加入500 mL菌液于38 ℃下180转/min吸附培养8 h得到耦合有特基拉芽孢杆菌的生物炭，常温风干后对其吸附菌量、表面形貌、元素组成、比表面积和pH进行表征分析。

采用土壤盆栽试验（每盆装土2.5 kg），共设5个处理，分别为空白对照（CK）、无菌培养基对照（SM，用添加量为3%v:w菌液：土的无菌发酵培养基进行灌根）、无菌生物炭对照（BC，添加3%w:w的灭菌生物炭）、特基拉芽孢杆菌液灌根处理（BT，用添加量为3%v:w浓度约4.5×10⁹ CFU/mL的特基拉芽孢杆菌液进行灌根）、特基拉芽孢杆菌耦合生物炭处理（BTBC，添加3%w:w的耦合有特基拉芽孢杆菌的生物炭，施用时生物炭含菌量约5×10⁹ CFU/g），各处理设4个重复，处理与基肥均在土壤装盆时一并施入，基肥用量为每kg土施入N 0.15 g、P₂O₅ 0.15 g、K₂O 0.20 g。在种植前，用5% NaClO消毒小白菜种子30 min，洗净后播入土壤，并在长至两叶一心时定苗，每盆3株，在培养45 d后收获。

吸附菌量参考Huang等^[14]的方法进行涂布计数；采用元素分析仪（Elementar，Vario EL cube）测定样品中CHNOS元素的含量，在消解后分别采用凯氏定氮法与火焰光度法测定全磷和全钾含量；使用扫描电镜（Thermo Scientific，Apreo 2S）对生物炭表面进行采集扫描；采用BET法（Micromeritics，ASAP 2460）测定生物炭的比表面积与介孔结构；使用pH计（Mettler Toledo，FE28）测定pH。

在小白菜收获时测定株高，并记录地上部的鲜重与干物重。

使用pH计以1:2.5的土水比测定土壤pH；采用三氯化六氨合钴浸提―分光光度法测定土壤阳离子交换量（CEC）；采用重铬酸钾容量法测定土壤有机质；采用碱解扩散法测定土壤碱解氮含量；采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定土壤有效磷含量；采用乙酸铵浸提―火焰光度法^[15]测定土壤速效钾含量。

使用DNA提取试剂盒（DP812，天根生化科技有限公司）提取土壤DNA，使用酶标仪（基因有限公司，synergy HTX）对核酸进行浓度检测，使用PCR仪进行扩增，扩增引物为27F_（16S-F）5'-AGRGTTTGATYNTG GCTCAG-3'和1492R_（16S-R）5'-TASGGHTACC TTGTTASGACTT-3'），在PacBio Sequel II平台（Pacific Biosciences）测序后使用QIIME2（2020.6）软件中的dada2方法对测序序列进行去噪获得ASVs。

使用Excel 2019进行数据统计，使用SPSS 18进行单因素方差分析与组间显著性检验（Duncan，t<0.05），使用OriginPro 2021进行绘图。

使用扫描电镜对吸附前后的生物炭超微结构进行观察（图1），可见生物炭的每个孔管直径约5~10 μm，远大于特基拉芽孢杆菌的细胞尺寸，其多孔结构与表面褶皱为细菌的附着与定殖提供了有利环境，结果显示特基拉芽孢杆菌主要吸附在生物炭的管状结构、蜂窝孔洞以及外表面上，吸附数量大且分布均匀。通过平板计数法测定了不同保存时间下生物炭上的活菌数，如图2所示，在0 d生物炭上的活菌数可达2.3×10¹⁰ CFU/g，而随着保存时间的延长活菌数会逐渐下降，并在90~180 d间稳定于10⁸ CFU/g左右。

对吸附前后生物炭的元素组成及比表面积进行分析，结果（表1）表明吸附了特基拉芽孢杆菌生物炭的pH、总碳、总钾含量较原始生物炭分别下降了4.5%、20.7%和16.1%，总氮和总磷含量则分别上升了43.4%和470.6%，比表面积和孔体积均发生了大幅的降低，降幅分别为67.6%和50.0%，这进一步反映了特基拉芽孢杆菌在生物炭表面的吸附定殖。

如图3所示，相较于CK，SM、BC、BT、BTBC处理的地上部鲜干重和株高均显著提升，BT处理相较CK与SM对照地上部鲜重分别显著提升了105.0%和52.6%，株高提升28.0%和12.4%；相较BC和BT处理，BTBC地上部鲜重分别显著提升了16.2%和14.2%，而株高无显著差异。以上结果表明，生物炭耦合特基拉芽孢杆菌相较单独使用生物炭或菌液可更好地促进小白菜的生长。

由图4可见，除SM处理对土壤养分无显著影响外，BC、BT、BTBC处理均改变了土壤的养分含量。在土壤pH方面，BC、BTBC较CK显著提升了0.90和0.75，其余处理间无显著差异；在土壤有机质方面，BC、BT、BTBC处理较CK显著提升了土壤有机质含量，提升幅度分别为94.6%、13.4%和67.8%；在土壤有效磷方面，各处理间无显著差异；在土壤速效钾方面，BC、BT较CK显著提升了速效钾含量，提升幅度分别为67.1%和31.8%；在土壤碱解氮方面，BT、BTBC处理较CK显著增加，提升幅度分别为12.4%和12.1%；在阳离子交换量方面，BC、BT和BTBC处理较CK均有显著提升，提升幅度分别为39.7%、13.5%和23.2%。总体而言，相较于BT处理，BTBC处理显著增加了土壤pH、有机质、速效钾含量；相较于BC处理，BTBC处理的有机质、阳离子交换量和速效钾含量有所降低，而土壤碱解氮水平显著增加。

通过基于Bray-Curtis的PcoA分析了处理间的β多样性，结果（图5a）表明所有处理均较CK显著改变了根际细菌群落，其中SM和BT处理对细菌的影响相近，而BC与BTBC处理的影响相近。由图5b可见，BC、BT和BTBC处理相较CK显著增加了21.9%、12.5%、24.2%的根际OTU数量，其中BTBC相较BT处理有显著提升。分别用Chao1指数与Shannon指数评估了不同处理对根际细菌多样性及丰富度的影响，结果（图5c~d）显示，BC、BT和BTBC处理的群落丰富度和多样性相较CK、SM对照均显著增加，其中BC和BTBC处理的群落丰富度与BT无显著差异，而多样性较BT处理显著增加。综上说明，BC、BT和BTBC处理较CK、SM均显著增加了根际细菌种群丰度与多样性，其中BC、BTBC处理下的细菌群落丰富度与多样性要显著高于BT处理。

在目分类水平下（图6a），根际优势菌目分别为伯克氏菌（Burkholderiales）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonadales）、酸杆菌（Acidobacteriales）、噬几丁质菌（Chitinophagales）和根瘤菌（Rhizobiales），这5种菌目的相对丰度占总群落的49%~59%。BT处理较CK与SM对照主要增加的物种分别为芽孢杆菌目（Bacillales，1.9倍）和出芽小链菌目（Blastocatellales，1.3倍）的相对丰度；而BTBC处理较CK、BC、BT的增加物种均为芽孢杆菌目（25.2、76.8、8.0倍）和噬几丁质菌目（3.8、0.2、1.5倍）。

在属分类水平下（图6b），根际优势菌属分别为鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、马赛菌（Massilia）、副伯克霍尔德菌（Burkholderia_ Caballeronia_Paraburkholderia）、酸杆菌（Acidobacteriales）和黄色土壤杆菌（Flavisolibacter），这5种菌属的相对丰度可占总群落的49%~58%。BT处理较CK与SM对照的主要增加物种分别为芽孢杆菌属（Bacillus，1.9倍）和出慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium，0.5倍）；而BTBC处理较CK、BC、BT均增加了芽孢杆菌属（18.5、59.4、5.8倍）和黄色土壤杆菌属（4.4、0.2、1.8倍）的相对丰度。

对平均相对丰度超1%排名前15个属级物种和环境因子进行冗余分析，结果（图7）显示，RAD1轴解释了总变异量的58.04%，RDA2轴解释了6.72%。土壤的pH（R²=0.92，P<0.01）、有机质（R²=0.94，P<0.01、阳离子交换量（R²=0.82，P<0.01、碱解氮（R²=0.65，P<0.01）和速效钾（R²=0.42，P<0.05）是影响根际细菌群落的显著因子。使用Pearson相关性分析发现土壤pH、有机质与出芽单胞菌的相关性最强（R²=0.82，P< 0.01），CEC与沙壤土杆菌的相关性最强（R²=0.91，P<0.01），碱解氮与鞘氨醇单胞菌的相关性最强（R²=0.72，P<0.01），速效钾与黄色土壤杆菌的相关性最强（R²=0.76，P<0.01），有效磷与菌属无显著相关性。

生物炭是一种富含矿质养分及有机质的碳质材料，被广泛用于土壤改良和地力提升，其不仅能提高土壤养分与促进作物生长，所特有的多孔结构还可用于固定微生物并提高外源微生物在土壤的定殖率^[16-17]。本研究中采用扫描电镜、BET比表面积和分离计数等手段证明了可通过吸附法将特基拉芽孢杆菌稳定吸附并定殖在生物炭上。前人^[4]研究表明，PGPR与生物炭的联合施用具有复合增效作用，可更有效地改善土壤质量与提高农业生产力，如Ren等^[18]的研究显示，定殖巨大芽孢杆菌生物炭的可显著提升土壤的无机氮与全钾水平，Jabborova等^[19]也报道了接种根瘤菌的生物炭可显著提高土壤的全量氮、磷、钾含量及蛋白酶、磷酸单酯酶活性并促进了花生的生长与养分积累。本研究结果显示，BTBC处理显著增加了土壤的pH、碱解氮、速效钾和阳离子交换量，并显著增加了小白菜的株高与产量，原因一方面是由于特基拉芽孢杆菌具有分泌IAA、赤霉素与ACC脱氢酶能力，可刺激促进植株的养分吸收与积累^[20-21]，另一方面则是生物炭的施用可以有效改善土壤结构并提高土壤酶活性^[22-23]，从而提高土壤的养分有效性以实现作物的高产。

本试验通过对比发现，单施生物炭（BC处理）的土壤有机质、速效钾含量和阳离子交换量均要高于BTBC处理，计算吸附前后生物炭的元素含量变化（表1）可知，这是由于生物炭孔隙中被菌体定殖后，生物炭密度增加而造成碳、钾、CEC等元素含量相较原始生物炭有所下降。但在碱解氮方面，我们发现BTBC处理与单施特基拉芽孢杆菌（BT）要显著高于其他处理，这说明BTBC处理对土壤有机质、速效钾及CEC的提升主要来源于生物炭本身释放的养分，而其对土壤碱解氮的提升则是由于特基拉芽孢杆菌可将空气的分子氮固定为植株可利用的铵态氮，从而显著提高土壤的有效氮水平^[21,24]。Gou等^[17]研究也支持这一结论，耦合固氮菌的生物炭可通过提高土壤固氮微生物丰度与固氮酶水平而提高土壤有效氮，Wen等^[25]也报道了丛枝菌根结合生物炭的施用可通过增加丛枝菌根在根部的定殖来提高土壤的碳氮含量并促进作物的养分吸收。

土壤微生物群落多样性及其组成是反映土壤肥力与健康状况的重要指标，结果显示单独施用特基拉芽孢杆菌菌液或生物炭均能显著增加小白菜根际细菌的丰度与多样性，且二者耦合施用时提升幅度更大，这是由于土壤pH与矿质养分直接影响着土壤酶活性与微生物代谢，BTBC处理下有效提高了土壤pH及养分水平，因此更好地支持了微生物在土壤中的定殖与生长^[17-18,25]。本文通过对比处理间群落多样性及组成可见，BC与BTBC处理在总体上有着更相近的群落结构，而BT与BTBC则有着相同的差异微生物（Bacillales目-Bacillus属），同时BTBC的增加倍数要远大于BT处理，这与前人^[6,26-27]研究一致，土壤微生物群落主要受到环境因素的影响，而BTBC与BC处理在土壤pH、有机质、速效钾和CEC方面有着相似变化，因此其对菌群结构的影响会更为趋同，相较于BT处理，BTBC处理的芽孢杆菌丰度有着显著提升，说明作为载体的生物炭增强了菌株在土壤中的存活与增殖。结合冗余分析可发现，在BTBC处理下与土壤有机质强相关的黄色土壤杆菌属和出芽单胞菌属具有促进土壤碳固存、碳循环以及分解多环芳烃的功能^[9,28-29]，而与土壤碱解氮含量正相关的芽孢杆菌、慢生根瘤菌和鞘氨醇单胞菌则是被广泛报道的固氮细菌^[24,30-31]，说明生物炭本身的投入增强了细菌群落对土壤有机碳的代谢循环能力，同时其耦合的特基拉芽孢杆菌可能还协同促进了其他固氮细菌在根际中的增殖，从而提高根际细菌群落碳氮循环的功能丰度，有效改善了根际菌群结构与土壤肥力。

本研究以耦合特基拉芽孢杆菌的生物炭为试验材料，通过盆栽培养试验探究了生物炭耦合特基拉芽孢杆菌对小白菜根际土壤养分与细菌群落结构的影响，研究发现生物炭耦合特基拉芽孢杆菌相较单施菌液或单施生物炭显著增加了小白菜产量；生物炭耦合特基拉芽孢杆菌的施用显著增加了土壤的pH、碱解氮、速效钾、有机质及CEC，改善了土壤肥力状况；生物炭耦合特基拉芽孢杆菌显著提高了小白菜根际细菌群落多样性，并显著增加了芽孢杆菌、黄色土壤杆菌属、出芽单胞菌属、慢生根瘤菌和鞘氨醇单胞菌等PGPR的群落丰度。