豆科植物由于其丰富的蛋白质含量及高效的固氮能力成为植物蛋白的主要来源，同时也在农业可持续发展中发挥了重要的作用。扁豆（Lablab purpureus）作为一种多用途的豆科植物，由于出色的抗旱耐热能力，广泛种植于中国、东南亚及非洲地区^[1]。扁豆嫩荚能够作为蔬菜食用，成熟豆粒也能够作为粮食，是淀粉的来源之一。由于其巨大的生物量，扁豆还可作为青贮饲料用于畜牧业或杂草的生物防控。此外，研究^[2]发现扁豆中的生物活性成分能够对SARS-Cov-2病毒产生抑制作用。

目前，全球已登记的扁豆种质资源超过3000种^[1]，但这些扁豆资源的研究及开发利用尚处于初级阶段。我国是扁豆的主要种植地区之一，扁豆种质资源丰富，但分布较分散，且种质保存机构间相互独立收集保存，造成同种异名、同名异种及种质间亲缘关系不清等问题，这对扁豆资源的保存利用、育种选择及优良品种推广造成不便。因此，调查扁豆种质资源的表型性状，并结合分子标记技术分析扁豆资源的遗传多样性、探究不同资源之间的亲缘关系及遗传差异对于我国扁豆资源的种质资源鉴定及高效利用具有重要意义。

通过鉴定表型性状能够快速便捷地对种质资源信息进行分析。苏彩霞等^[3]利用12个数量性状指标及19个质量性状指标对江苏地区的扁豆资源进行分析发现，花序长短、荚厚、单株荚数等性状与产量密切相关；有研究^[4]发现扁豆茎、叶脉及苞叶颜色存在相关性，表明这些性状相关的基因紧密连锁或性状由单一基因控制。在印度地区对扁豆核心种质资源库中的64份资源进行表型分析后发现这些资源可分为6个类群，同时发现部分资源与产量相关的性状具有广范围的稳定性^[5-6]。

依赖表型性状进行分析虽然直观快捷，但由于其高度依赖于植物的生长阶段且极易受到环境因素的影响，仍存在低效且误差较大的弊端^[7]。基于DNA序列的分子标记由于其可用于植物生长全时期且不受环境影响，故可用于表型难以甄别性状的分析，并通过与表型性状相关的分子标记辅助进行资源筛选及育种工作。孟珊等^[8]利用SSR分子标记对江苏省的扁豆资源进行分析发现所有材料可划分为4个类群，姚陆铭等^[4]利用开发自大豆的SSR标记对不同地区的扁豆鉴定发现这些扁豆资源不存在明显的地域特异性。此外，Singh等^[9]利用印度地区的10份扁豆种质资源开发的AFLP标记能够有效地区分多份材料。

本研究结合17个表型性状及31对SSR标记对来自国内不同地区及印度、美国不同国家的115份扁豆种质资源进行群体遗传结构及亲缘关系分析，为扁豆资源的开发利用及品种的遗传改良提供理论依据。

供试的115份扁豆材料分别收集自中国上海（CNSH）、中国河南（CNHN）、中国黑龙江（CNHLJ）及印度（IND）、美国（US）地区（表1）。材料均先播种于穴盘中，在26 ℃人工气候室中生长至第1对真叶完全展开后，选取长势一致的幼苗移栽至试验大田中，采用双行种植方式，行距0.7 m，株距0.6 m，每一份资源种植10穴。正常田间管理。

参照《扁豆品种志（南方本）》^[10]对扁豆资源的农艺性状进行调查，并采集表型数据，其中对质量性状进行记录并赋值和分析（表2）。对数量性状直接观测记录实际数据。通过叶绿素测定仪TYS-A（北京中科维禾科技发展有限公司）读取叶绿素含量，并以SPAD值为叶绿素含量单位进行计算。

每份资源采集5个不同单株的幼嫩叶片，利用植物基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]进行叶片DNA提取，利用分光光度计对DNA的质量及浓度进行检测（Thermo Scientific）。

SSR引物根据已发表的适用于扁豆基因组的31对多态性引物合成^[4]，随机选取6份资源对SSR引物多态性进行验证。经验证31对引物在6份资源中均存在多态性，分别在31对SSR引物中的正向引物5′端添加FAM或HEX荧光标记染料，合成荧光引物，用于PCR扩增后进行毛细管电泳。

SSR-PCR反应体系总体积25 μL，其中包含DNA模版1 μL（20~50 ng），SSR正反向引物各1 μL（终浓度0.4 μmol/L），dNTP mix（5 μmol/L），Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH₂O 9.5 μL。PCR扩增条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，且每一循环降低0.5 ℃，72 ℃延伸30 s，10个循环；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃修复延伸10 min。

PCR扩增产物在以GeneScan 500 LIZ为内标的条件下，通过ABI 3730xl DNA Sequencer（Applied Biosystems）进行毛细管电泳检测。对检测信号利用Genemapper软件进行分析。

利用Microsoft Excel 2019计算表型性状的平均值、标准差及变异系数。利用SPSS 16.0软件计算各表型性状间的相关性系数及主成分。对于质量性状直接根据赋值（表2）计算多样性指数，对于数量性状根据其平均值及标准差分为10级^[11]，根据如下公式计算性状的Shannonʼs多样性指数（H′）=-∑i=1nPilnPi，式中，P_i表示某一性状第i级的分布频率，n为总分级数。利用SPSS 16.0对扁豆资源的数量性状进行相关性及主成分分析，通过系统聚类法中组间聚合的方法对材料农艺性状进行聚类。

对于毛细管电泳数据，根据GeneMapper软件输出结果，采用0/1赋值方法，在相同迁移位置处有信号的记为1，无信号的记为0，从而构建二元数据矩阵。利用Popgene32软件计算利用SSR标记检测到的等位基因数（N_a）、有效等位基因数（N_e）、Shannonʼs多态性信息指数（I）及遗传多样性指数（H_e）。利用NTSYSpc 2.10计算SSR分子标记间的遗传距离，并根据遗传距离矩阵通过非加权配对法UPGMA方法进行聚类分析，并绘制聚类图。利用NTSYSpc 2.10中的DCENTER和EIGEN模块进行种质资源间的主成分分析。利用Structure 2.3.4软件分析种质资源的遗传结构，设置参数为最佳群体组群数K的取值范围为1~10，Burnin Period值设置为5000，MCMC值设置为50 000，每个K值重复运行20次，依据似然值最大原则选取合适的K值为群体数目。

对扁豆资源的9个质量性状进行分析（表3）发现，扁豆资源中下胚轴颜色以紫色至深紫色为主（86.09%），少数为绿色；叶脉颜色分布比例与下胚轴相似，也以紫色至深紫色为主（66.09%）；翼瓣色（花色）以紫色为主（93.91%），极少数为白色（6.09%）；嫩荚主色中紫色与绿色所占比例相近，而嫩荚次色则以紫色为主（70.43%），其次为绿色（20.87%），红色最少（8.70%）；荚形以扁条形为主（75.65%），少数为长条形（23.48%），极少数为细长条形（0.87%）；种子形状以卵圆形为主（83.48%），少数为圆形（16.52%）；种皮主色以黑色为主（65.22%），少数为棕色（29.57%），极少数为黄色（5.22%）；种皮次色以红色为主（68.70%），其次为黑色（26.09%），极少数为棕色（5.22%）。

所调查的扁豆资源质量性状共存在25种变异类型，其平均多样性指数为0.72，其中叶脉颜色存在4种变异类型，遗传多样性指数最高（1.19）；下胚轴颜色、嫩荚次色、荚形、种皮主色及种皮次色各存在3种变异类型；翼瓣色、嫩荚主色及种子形状各存在2种变异类型，其中翼瓣色遗传多样性指数最低（0.23）（表3）。

对扁豆材料的8个数量性状进行多样性分析（表4），分析发现其性状变异系数范围为8.97%~ 36.23%，说明扁豆资源中存在丰富的变异类型。与营养器官性状相关的叶绿素含量变异系数最小；与产量相关的豆荚性状的变异较大，其中荚宽、荚厚及单荚重的变异系数均高于30%。

对扁豆资源数量性状进行相关性分析，结果（表5）显示，荚宽与始花天数之间存在极显著负相关，荚长与百粒重之间存在显著正相关。其他性状之间相关性未达到显著性水平。

为了进一步分析各表型性状在扁豆资源多样性构成中发挥的作用，对115份扁豆资源的17个表型性状进行主成分分析。以特征值及贡献率作为主成分选择标准，提取特征值大于1.0的主成分。结果（表6）显示，前9个主成分累计贡献率77.39%，表明这9个主成分可反映扁豆资源的大部分遗传信息。

第1主成分特征值3.13，贡献率17.93%，主要包含植株颜色性状（下胚轴、叶脉、翼瓣及嫩荚次色）；第2主成分特征值1.82，贡献率11.15%，主要包含果实及种子性状（荚形、种子形状及种皮颜色）；第3主成分特征值1.75，贡献率10.66%，主要包含叶绿素含量、荚厚及种皮次色等性状；第4主成分特征值1.25，贡献率8.35%，主要包含荚宽及荚重等豆荚性状；第5主成分特征值1.22，贡献率7.09%，主要包含始花天数、荚宽及嫩荚主色等产量相关性状；第6主成分特征值1.15，贡献率6.36%，主要包含百粒重及种皮主色等种子相关性状；第7主成分特征值1.06，贡献率5.81%，主要包含花序长度及荚形等性状；第8主成分贡献率5.31%，主要包括种皮主色；第9主成分贡献率4.73%，主要包含叶绿素含量。由此可见，上述17个性状指标能够作为主要指标对扁豆种质资源进行评价。

31对SSR引物在115份扁豆材料中共检测到106个多态性位点，每对引物检测到的平均等位基因数为3.42个，其中Satt393及Satt522检测到数量最多，为5个；Satt284及Sctt011检测到数量最少，为2个。平均有效等位基因数目为1.96个，有效等位基因数目所占比例为57.19%。引物的多态性信息含量PIC范围为0.05~0.69，平均PIC值为0.38。群体平均I值为0.76，其中Satt702的I值最高，为1.37，而Satt284的I值最低，为0.12。平均H_e为0.45，其中最高为0.74（Satt702），最低为0.05（Satt284）（表7）。

对115份扁豆资源的17个农艺性状进行聚类分析，结果（图1）显示，在遗传距离为3.8时，可将扁豆资源分为6个类群。类群I包含58份材料，其主要特征为开花最晚，平均始花天数为57.05 d，其他性状均处于中间水平；类群Ⅱ包含26份材料，所有农艺性状均处于中间水平；类群Ⅲ包含3份材料，其主要特征为荚极宽，其平均值为73.83 mm，故该类群可以作为荚形状选育的主要材料来源；类群Ⅳ包含7份材料，其主要特征为开花晚，平均始花天数为56.57 d，但单荚重、荚长及种子百粒重值均最高，分别为6.29 g、106.04 mm及52.34 g，该类群可以作为扁豆高产品种进行开发；类群Ⅴ包含8份材料，其主要特征为花序长度最长，其平均值为34.72 cm，可以作为观赏性扁豆品种的材料来源；类群Ⅵ包含13份材料，其主要特征为开花早，平均始花天数为41.38 d，花序最短，平均长度为19.39 cm，单荚重及荚长均处于较高水平，分别为5.95 g及83.32 mm，该类群可以作为早熟、高产品种进行选育（表8）。

根据SSR分子标记对115份扁豆资源进行聚类分析。结果（图2）显示，在遗传距离为0.88的位置可将全部种质分为2个类群（I~V为第1类群，VI为第2类群），其中第1类群包含114个材料，第2类群仅包含1份材料；在遗传距离为0.84的位置，第1类群又可划分为2个亚类群（I为第1亚类群，II~V为第2亚类群），其中第1亚类群包含21份材料，第2亚类群包含93份材料；在遗传距离为0.80的位置，第2亚类群可细分为4个小类群，其中类群Ⅱ及类群Ⅲ为主要类群，分别包含41份及47份材料。由此可将扁豆资源划分为6个类群，主要类群中均包含国内及国外的扁豆材料。

依据位置近则亲缘关系近、位置远则亲缘关系远的原则，根据SSR分子标记结果进行主成分分析，并以第1及第2主成分为坐标绘制扁豆资源的二维主成分分析图。结果（图3）显示，扁豆资源的分布规律与UPGMA聚类分析得到的聚类结果相似，即聚类分析中能够归于同一类群的材料在PCA分析中也呈现相对集中分布的趋势。同时扁豆种质资源并未按照地理来源进行划分，不同来源的材料之间存在交错分布的现象。

对115份扁豆资源的群体进行遗传结构分析。结果（图4a）显示在K值为1~10时，ln P(D)值随K值的增大而增大。根据ΔK的数值来确定115份扁豆材料的最优群体数（K值），当K=2时似然值最大（图4b），说明所分析的扁豆资源从遗传结构角度能够分为2大类群。同时发现9份材料Q值小于0.6，提示该9份材料存在较为复杂的遗传背景，无法对其归属类群进行明确划分；其余106份材料Q值均大于0.6，能够将其明确划分至2个遗传群体中，其中第1类群包含50份扁豆材料，第2类群包含56份材料，材料分布未按照地理来源进行区分（图4c）。

为了分析扁豆资源的地理来源与遗传分组之间的关系，分别对各来源地中基于SSR标记的各类群及基于遗传结构的各分组所占比例进行统计（图5），并分析地理来源与遗传组分之间的相关性。结果显示不同地理来源无法影响基于SSR的遗传分组（P=0.532）及基于遗传结构的群体分组（P= 0.345），即地理来源与遗传分组之间不存在相关性。

作物种质资源的遗传多样性是选育作物新品种的物质基础^[12]，表型性状及分子标记是遗传多样性研究中常用的方法。表型性状能够直观快捷地反映种质资源的特性，但易受环境因素影响，分子标记则能够从DNA水平反映遗传差异性，且表现稳定，多态性位点数量丰富。本研究对115份扁豆种质资源的9个质量性状及8个数量性状的遗传多样性进行分析，发现表型性状的遗传多样性指数范围为0.23~1.19，且数量性状的变异系数在8.97%~ 36.23%，表明扁豆种质资源中存在丰富的表型变异类型，同时研究发现质量性状的遗传多样性指数普遍低于数量性状，这种现象在扁豆及谷子等植物中已有报道^[8,13]，造成这种现象的原因可能与研究材料及所调查性状差异有关。对扁豆种质资源数量性状进行研究时发现荚及种子相关性状的多样性指数均较高（H′>1），对荚及种子其他表型进行研究同样发现其存在广泛的变异^[8,14]，由此可见，扁豆资源中与单株产量相关的性状存在丰富的遗传多样性，故利用不同种质资源对产量性状进行改良具有巨大的空间。

本研究利用SSR分子标记对扁豆种质资源DNA水平上的遗传多样性进行了分析。结果显示扁豆资源的DNA水平上的遗传多样性低于表型多样性（H_e<1），这种现象同样存在于江苏省及湖南省的扁豆资源中^[8,15]，造成这种现象的原因可能是由于所选用的分子标记覆盖扁豆基因组程度较低，无法全面反映扁豆遗传信息。本研究应用的SSR标记借鉴自大豆分子标记，且目前所公布的扁豆基因组仍停留在草图阶段，故标记并未覆盖全基因组^[16]，在一定程度上无法全面体现扁豆资源的遗传多样性。本研究中共发现4个高多态性SSR标记（PIC>0.5），可作为理想的扁豆种质资源遗传多样性评价的SSR标记。先前亦有报道^[9]针对扁豆基因组开发的AFLP标记中存在高多态性的标记可用于扁豆资源鉴定。由此可见，能够使用多种高多态性的分子标记对扁豆资源的遗传多样性进行有效分析。

本研究对扁豆资源进行分析发现，不同扁豆材料之间存在显著差异，而多个性状之间存在一定程度的相关性，其中荚宽与始花天数之间存在极显著的负相关，荚长与百粒重之间存在显著正相关。不同性状之间的相关性在其他研究中亦有报道，江苏省扁豆资源中生育期与产量相关的荚性状存在显著相关性^[3]，而对印度的扁豆资源研究^[17-18]中也发现了相同的现象，由此推测，扁豆资源中与产量相关的豆荚及种子的性状同生育期之间存在普遍的相关性，因此，在引进及选育不同生育期的扁豆品种时可由生育期对产量做出一定程度上的推测。此外，本研究对扁豆种植资源的表型性状进行主成分分析，将17个表型性状简化为9个主成分，选出植株颜色因子、花及花序性状因子、豆荚及种子性状因子、生育期因子及产量相关因子，在非洲地区进行的扁豆资源研究中也发现相类似的主要因子^[14]，由此说明上述用于主成分分析的因子能够对扁豆资源进行综合评价。

本研究依据17个表型性状将115份扁豆资源分为6个类群（图1），各类群之间存在明显特征差异，而每一类群内个体间存在相似的特性，且类群区分并不以扁豆种质资源的来源地为主要依据。在对江苏省的扁豆资源进行聚类分析时也发现了扁豆材料以表型特征为依据进行聚类且与地理来源无严格一致性关系^[3]。类似的规律在其他植物中也有报道，如依据表型对不同省份的芝麻进行分类时不同类群的区分并不与省份来源相对应^[19]，而对谷子进行聚类时发现不同生态区的材料能够依据其表型特征划分至同一类群中^[13]。表型聚类分析结果与种质资源来源地之间的差异可能是由于种质资源及考察目标性状差异导致的，也有可能是不同来源的种质资源之间存在相互交流导致了性状的平均化。

本研究在SSR分子标记对扁豆种质资源多态性进行分析的基础上，通过UPGMA聚类方法、PCA主成分分析及Structure群体遗传结构分析分别对扁豆种质资源进行分类。结果显示，3种分析方法对资源的划分存在差异。UPGMA聚类分析将扁豆种质资源在遗传距离为0.88的位置划分为6个类群，PCA主成分及群体遗传结构分析则将其划分为2个主要类群，同时PCA分析与UPGMA聚类结果相对一致，类群I与其他5个类群相对独立，其他5个类群分布相对集中，但各群体内部仍呈相对集中分布趋势。群体遗传结构分析结果与上述二者在类群中资源分布存在较大差异。这种现象在谷子^[13]、烤烟^[20]及雪茄烟^[21]等植物种质资源分析中同样有报道，这种差异可能是由于不同的分类依据造成的，其中聚类分析及PCA分析以资源间的亲缘关系为依据，故分类结果上存在一定程度的一致性，而群体遗传结构分析则以Hardy-Weinberg平衡为依据^[20]。然而，分析结果均显示115份扁豆资源的分类结果与其地理来源无明显相关性，即不同类群中均包含有多个来源地的资源，这在对江苏省的扁豆资源进行分析时也发现了类似的现象^[8]。由此说明扁豆资源遗传背景较为复杂，且相互之间存在自然或人为的遗传信息交流。

本研究对115份扁豆资源的17个表型性状进行考察，并利用31对SSR引物对其进行遗传多样性分析。结果表明，这些资源遗传差异性显著，遗传多样性丰富。分析发现扁豆资源遗传背景较为复杂，不同地理来源的资源之间存在基因信息的交流。这些结果为今后扁豆资源的利用及优良扁豆品种的选育提供了材料基础及理论指导。