稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的一种突发性强、易流行的水稻病害,是世界各水稻产区分布广泛的重要病害之一。水稻与稻瘟病菌是典型的特异性识别和互作模式^[1,2],利用寄主抗性,选育和种植抗病品种可以有效地控制该病的发生。随着分子标记技术的发展和水稻基因组测序的完成,已有大量稻瘟病抗性基因被定位和克隆。迄今为止,至少报道了69个位点的100多个稻瘟病主效抗性基因,其中约45%来源于粳稻,51%来源于籼稻,4%来源于野生稻^[3]。由于QTL表达受环境等因素影响较大,长期以来抗病育种中应用的大都是主效抗病基因。目前已鉴定出的抗病基因组成可为品种的合理布局、轮换防治稻瘟病以及选用抗病基因进行抗病育种提供重要的信息。

黑龙江省水稻品种处于不断更新当中,每年都会有新品种的选育和审定,水稻产量也不断提高,为黑龙江省的粮食生产提供了强有力的保障。但目前黑龙江省水稻品种还存在审定品种与骨干亲本亲缘关系较近和遗传背景高度相似等问题,因此如何选择骨干亲本、延长选育品种的使用寿命、提高品质和增强抗性至关重要,需要对大面积种植的品种进行慎重选择和抗瘟性监测。近年来,程芳艳^[4]分析了部分抗瘟基因在东北三省水稻品种中的分布以及黑龙江省的水稻亲缘关系,表明对黑龙江省利用价值较高的抗瘟基因有Pi3、Pi9、Pi12和Pi20,筛选出龙粳31、龙粳37和龙粳39等抗瘟性较好的品种;辛威^[5]利用8个稻瘟病抗性基因的功能性分子标记筛选225份黑龙江省水稻种质资源,鉴定出14个宽抗谱品种,含有2~7个抗稻瘟病基因;相亚超等^[6]对102份水稻种质的部分抗稻瘟病基因进行分子检测,结果表明Pi2/Pizt、Pita和Pi5对黑龙江省水稻稻瘟病抗性贡献较大,Pita和Pi5聚合时对黑龙江省水稻抗瘟性改良效果较好。

本研究利用稻瘟病抗性基因与其感病等位基因间的序列差异设计特异性分子标记,对20个黑龙江省粳稻品种进行主效抗瘟基因鉴定与抗病性评价,分析已克隆的8个抗瘟基因在供试黑龙江省粳稻品种中的分布情况,明确抗瘟基因的聚合效果及抗性贡献,评价品种利用价值,以期为黑龙江省水稻抗病育种工作提供参考依据。

以黑龙江省各水稻种植区主要推广的20个常规粳稻品种为材料,其中适宜种植于第1积温带的品种有6个,分别是龙洋1号、龙洋16、松粳3号、松粳15、松粳20和稻花香2号;适宜第2积温带的品种有7个,分别是龙粳21、龙粳42、北稻3号、北稻4号、绥粳4号、垦稻12和垦稻23;适宜第3积温带的品种有7个,分别是龙粳26、龙粳29、龙粳31、龙粳40、龙粳43、龙庆稻3号和空育131。

抗病对照材料为IRBLta-K1（Pita）、IRBLa-A（Pia）、IRBLzt-T（Piz-t）、IRBLb-B（Pib）、IRBLkm-Ts（Pikm）、IRBL9-W（Pi9）、IRBLi-F5（Pii）和Digu（Pid3）。感病对照材料为丽江新团黑谷（LTH）。以上材料均由黑龙江省植物抗性研究中心提供。

于2013和2015年在黑龙江省22个县（绥化庆安、哈尔滨通河、哈尔滨木兰、哈尔滨依兰、哈尔滨延寿、哈尔滨五常、伊春铁力、佳木斯桦川、佳木斯汤原、双鸭山友谊、鸡西虎林、鸡西密山市、齐齐哈尔甘南、齐齐哈尔泰来、齐齐哈尔依安、大庆杜蒙、大庆肇源、绥化望奎、哈尔滨方正、哈尔滨尚志、佳木斯桦南和鹤岗绥滨）水稻种植区（图1）采集稻瘟病穗颈瘟标样,经单孢分离获得单孢菌株402个。

用于PCR扩增的特异性分子标记引物均参考已发表的文献资料,委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成,其名称、序列及扩增片段大小等信息见表1。

采用室内苗期水培法培育植株,挑选饱满的种子用25%的氰烯菌酯3000倍溶液消毒后浸种3~4d（20℃）,清水冲干净放入培养皿内,于28℃恒温培养箱内催芽48h,播种于固定在水培盒的定植篮内,每个定植篮播种10粒种子,置于培养架上,用自来水培养3d后,再用改良的Hoagland营养液^[19]培养,每3d更换一次营养液。

待水稻苗长至4叶期,采集叶片,利用CTAB法提取植物DNA,使用核酸蛋白测定仪测定DNA浓度,并将DNA母液稀释成50ng/µL的工作液,母液保存于-20℃。参考周弋力^[20]的方法,按照20µL的反应体系进行PCR扩增,Pii和Pid3按10µL的反应体系进行酶切,据产物大小在1.5%的琼脂糖凝胶或8%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,凝胶成像系统拍照观察。为确保结果准确、可靠,每个材料重复2次PCR步骤,第1次统计结果后,没有目标条带或条带不清晰的再重复进行PCR扩增和电泳。统计并记录最终结果。

将保存的402个单孢菌株在室内进行苗期人工接种,水稻植株培育同1.4,接种参考孟峰等^[21]的方法,接种后5d左右参照叶瘟病情调查标准^[22]记录发病情况。

利用Image Lab系统中的条带检测功能读取并记录电泳条带,采用Excel 2010进行数据处理。通过品种与病原菌相互作用的表现型,以抗性频率（resistance frequency,RF）代表水稻品种对稻瘟病的抗性强弱,同时对供试品种进行抗性评价（resistance evaluation,RE）,评价标准为RF≥80%为抗病（R）,60%≤RF<80%为中度抗病（MR）,40%≤RF<60%为中度感病（MS）,RF<40%为感病（S）,公式如下：品种稻瘟抗性频率（RF,%）=品种抗性为R和MR的菌株数/供试菌株总数×100^[23]。

利用分离的402个稻瘟病菌单孢菌株对20个粳稻品种进行抗性鉴定与评价,结果（表2）显示,在20个黑龙江省常规水稻品种中,抗病（R）品种有7个,占供试品种的35%;中抗（MR）品种有12个,占供试品种的60%;感病（S）品种仅有1个,占供试品种的5%。其中龙洋16抗性最好,抗性频率高达93.0%,空育131抗性最低,抗性频率36.3%。表明大多供试品种暂时有良好的抗病性,处于中抗以上,当下可根据气象环境条件适当种植。

2.2.1 抗瘟基因在供试粳稻品种中的分布情况 利用8个抗瘟基因对应的特异性分子标记分别对20个供试材料进行PCR检测,能扩增出相应目标片段大小的品种为含有该抗性基因,统计扩增条带,部分抗瘟基因类型检测见图2。结果（表3）显示,Pia检出率最高,20个粳稻品种均检测到该基因,其次是Pita和Piz-t,检出率均为80%。在20个供试粳稻品种中,有12个携带Pi9,10个携带Pikm,7个携带Pii,6个携带Pib,仅有1个（龙洋1号）携带Pid3。以上结果表明,供试粳稻品种在携带的已知稻瘟病抗性基因上存在明显差异,Pia、Pita和Piz-t总体应用较广。

2.2.2 抗瘟基因在不同积温带品种中分布情况 为明确不同生态类型品种携带的抗瘟基因是否存在差异,对主效抗性基因在供试粳稻中的分布频率进行比较,结果（图3）显示,Pita、Pia、Piz-t、Pikm和Pi9在3种生态类型品种中出现的频率相近,而Pib、Pii和Pid3频率不同。检测的主效抗性基因广泛分布于第1积温带的品种,除Pid3其余抗性基因频率均达50%以上;Pita、Pia、Piz-t、Pikm和Pi9在第2积温带的品种中应用较广;Pita、Pia、Piz-t和Pi9在第3积温带的品种中分布广泛。以上结果表明,Pia、Pita、Piz-t、Pikm和Pi9在不同生态型品种育种中得到了较为广泛的应用,Pib、Pii和Pid3在不同生态类型品种间分布不同,仅在第1积温带得到相对较好的应用。

2.2.3 粳稻品种携带抗瘟基因数量及基因型分析20个水稻品种均有检测到主效抗性基因,含有的基因数量从3~7个不等（表4）,有5个品种携带3个抗性基因,4个基因型;有8个品种携带4个抗性基因,5个基因型;有2个品种携带5个抗性基因,2个基因型;有4个品种携带6个抗性基因,4个基因型。有5个品种携带6个及以上基因,且其中松粳20携带抗性基因数达到7个,为供试粳稻中携带基因数最多的品种。结果表明,供试品种抗性基因组合类型丰富,且表现出明显差异。

为明确抗瘟基因类型或数量与品种抗病性间的相关性,对20个供试粳稻携带的抗瘟基因数量、类型与抗性表现进行关联分析。发现抗病基因数量与品种抗病性并无直接关联（表5）。

由表5可知,携带Pita+Pia+Piz-t基因聚合的品种均表现较好的抗病性,对黑龙江省粳稻品种的抗瘟贡献较大,说明这3个基因与其他抗瘟基因聚合对抗性贡献可能起到正向累加效果。其中携带Pita+Pia+Piz-t的2个品种也表现出较好的抗性,推测可能是携带未知抗性基因的新抗源,可作为进一步挖掘广谱持久稻瘟病抗性基因的材料。唯一携带Pid3的品种也表现较好的抗病性,推测Pid3与其他基因组合可能具有良好的应用价值。

目前,选育和合理种植抗病品种是控制稻瘟病流行发生最经济有效的途径,而抗瘟基因的挖掘与利用对抗病育种工作至关重要。因此,了解黑龙江省当前栽培品种的抗病性及抗瘟基因型,对抗病品种合理布局、有效防控稻瘟病和推进抗病育种工作具有重要意义。

本研究以20个黑龙江省粳稻品种为材料,利用特异性分子标记探明了Pita、Pia、Piz-t、Pib、Pikm、Pi9、Pii和Pid3主效抗病基因的分布特征,通过接种黑龙江省2013-2015年的稻瘟病菌株,明确了供试品种的表型抗病性,初步分析了被检测的主效抗性基因对抗病性的贡献。结果表明,供试粳稻品种携带的已知稻瘟病主效抗性基因相差较大,Pia、Pita和Piz-t总体应用较广。Pia、Pita、Piz-t、Pikm和Pi9在不同生态型品种育种中得到了较为广泛的应用,Pib、Pii和Pid3在不同生态类型品种间分布存在差异,仅在第1积温带得到相对较好的应用;供试水稻品种携带的被检测基因数量为3~7个不等,且基因组合类型较丰富,不同抗性基因组合发挥不同程度的抗病性;唯一携带Pid3的品种龙洋16抗性表现最好,推测Pid3与其他抗性基因组合可能具有良好的应用价值;携带Pita+Pia+Piz-t这类基因组合的品种均表现较好的抗病性,对黑龙江省粳稻品种的抗瘟贡献较大,说明这3个基因与其他抗瘟基因或未知抗病新基因的互作对水稻抗病性起到一定的正调控作用。

相亚超等^[6]研究表明,在黑龙江省102份水稻资源中,Pita的检出率为31.47%,且与其他基因聚合的抗病率为87.50%,携带Piz-t的水稻品种有90%表现抗病,认为Pita和Piz-t对黑龙江省水稻抗稻瘟病贡献较大,与本研究结果相似;在102份水稻资源中没有检测到Pi9,与本研究Pi9检出结果有所差异,其原因在于前者选用的引物Pi9-Pro是同时检测Pi9、Pi2和Piz-t 3个等位基因的,仍需利用其他分子标记进一步检测和鉴定;程芳艳^[4]研究表明,27个黑龙江水稻品种中只检测到2个携带Pib,且抗性较低,利用价值不高,与本研究结果相似;李莹^[24]研究表明,Pid3导入空育131中,其后代均表现为良好抗病性,Pid3对黑龙江省稻瘟病菌株具有较好抗性,与本研究结果类似。徐未未等^[25]研究表明,抗性基因之间在一定程度上存在互作,从而协同抵抗单个抗性基因不能抵抗的生理小种,拓宽抗谱,增强抗病性,本研究的供试品种基因聚合与抗病性关联的分析也说明了该问题,多基因聚合不只是简单的累积效应,而是存在更加复杂的互作效果。迄今已有超过30个抗稻瘟病基因被克隆,本研究仅鉴定了其中8个主效抗病基因,因此下一步应更加全面完整地了解抗病基因分布情况,继续扩大表型评价接种数量以及选择其他分子标记鉴定抗病品种基因型,深入挖掘具有持久广谱抗性的基因,注重分子检测与表型鉴定相结合,明确抗性基因贡献率,在抗病育种中注意亲本选择,培育持久广谱抗病后代。

20个黑龙江省粳稻品种的稻瘟病抗性基因鉴定和抗性评价结果表明,大多供试常规品种暂时保有良好的抗病性,处于中抗以上水平。Pia、Pita和Piz-t无论是单基因抗性效果还是聚合抗性在黑龙江省水稻品种中均表现较好,Pid3具有良好的应用潜力,被检测的主效抗病基因在不同生态型品种中分布有差异,品种抗性表现不仅仅是单基因抗性的累加效果。结果为黑龙江省抗病种质资源布局以及稻瘟病抗性基因利用提供了一定的理论参考。