2020年我国油料总产量接近世界总产量的9%，但消费量占全世界消费量的23%，植物油的自给率不足30%，呈逐年下降趋势，巨大的消费缺口导致油料严重依赖进口^[1]。甘蓝型油菜（Brassica napus）是我国重要的油料作物之一，2020年油菜的种植面积占油料作物面积51.52%，产量占自产油料作物的39.17%^[2]。研究^[3]表明，每增加1%的油菜籽含油量相当于提高油菜籽产量2.3%~2.5%，提高油料作物含油量以及单位面积油脂产量对于满足油料作物育种目标至关重要。

植物脂肪酸合成是一个复杂的生物学过程，由溶血磷脂酸（LPA）向磷脂酸（PA）的转化是脂肪酸合成的一个重要的步骤，PA经脱磷酸后生成三酰甘油（TAG），TAG不仅是植物脂质的重要成分，还参与生物膜的形成以及信号转导^[4⇓-6]。溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶（lysophosphatidylcholine acyltransferase，LPAT）又称溶血磷脂酸酰基转移酶（lysophosphatidic acid acyltransferase，LPAAT）或酰基甘油磷酸酰基转移酶（acylglycerolphosphate acyltransferases，AGPAT），是上述途径的一个关键限速酶，在植物脂肪酸的积累和代谢中起着至关重要的作用^[7-8]。异源过表达BnLPAT增加了拟南芥种子含油量^[9]；在酵母中表达三角褐指藻LPAAT基因明显提高了脂肪酸含量^[10]。截至目前，LPAAT基因在许多植物中均被鉴定到，包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）^[11]、棉花（Gossypium raimondii）^[12]、花生（Arachis hypogaea）^[13]、紫苏（Perilla frutescens）^[14]等。

随着甘蓝型基因组测序的更新和转化体系的建立，通过基因编辑技术和转基因技术改良油菜育种成为了可能^[15-16]。截至目前，在甘蓝型油菜全基因组水平上还未对LPAT基因家族进行系统分析。本研究首次在全基因组水平上确定了BnLPAT家族的成员，并对它们进行了系统进化、顺式作用元件和表达模式分析，结果为研究油菜LPAT基因的功能提供了理论基础。

甘蓝型油菜中双11（ZS11，高含油量）、绵油16（MY16，低含油量）和绵油32（MY32，中含油量）于2022-2023年种植在四川省绵阳市农业科学研究院内试验基地。分别于花后（days after flowering，DAF）0（花序）、7、14、21、28、35、42 d收集中双11不同发育阶段的种子，绵油16、绵油32的种子于DAF 28和35 d收集，立即放入液氮中速冻，之后转移到-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

甘蓝型油菜中双11（Brana_ZS_V2.0/）、白菜（Brapa_genome_v3.0）以及甘蓝（Boleraceacapitata_ 446_v1.0）数据库下载自网站BRAD（http://www. brassicadb.cn/#/）。使用下面2种方法鉴定来自甘蓝型油菜、白菜和甘蓝LPAT的成员：（1）在Pfam数据库（http://pfam-legacy.xfam.org/）下载LPAT家族成员保守结构域的隐马尔可夫模型PF01553，并使用Hmmsearch（https://hmmer.janelia.org/）程序在中双11蛋白数据库中进行检索，删除E-value>e^-10以及多余的转录本；（2）利用拟南芥LPAT蛋白序列进行BLASTP同源比对到甘蓝型油菜蛋白数据库中，最后利用NCBI-CDD（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）和SMART（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd. shtml）确认是否具有LPAT成员保守结构域。利用Expasy网站（https://web.expasy.org/protparam/）进行理化性质预测，在网站Plant-mPLoc（http://www. csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行亚细胞定位预测。基因染色体位置信息和序列等均从Ensemble Plant数据库（https://plants.ensembl.org/ index.html）下载。

利用Clustal W软件^[17]对拟南芥和甘蓝型油菜LPAT蛋白进行多序列比对。利用MEGA 7.0^[18]进行临近法系统进化树的构建，其中Bootstrap设置为1000个循环，其他参数系统默认，最后利用Evolview（http://www.evolgenius.info/evolview）进行可视化分析。根据之前研究^[19]方法认定基因复制类型，并利用TBtools软件^[20]进行基因染色体定位和复制关系可视化分析。

将甘蓝型油菜LPAT基因的编码序列（CDS）、gDNA序列提交到GSDS 2.0（http://gsds.gao-lab. org/）在线网站上进行基因结构可视化。将蛋白质氨基酸序列提交到MEME（https://meme-suite.org/ meme/）在线网站上，设置保守基序数量为10。使用ClustaIW软件进行蛋白质多序列比对，将LPAT保守结构域比对结果在GeneDoc软件（https://nrbsc. org/gfx/genedoc/）上进行可视化。

将甘蓝型油菜LPAT基因上游2000 bp序列提交到PlantCARE数据库（https://bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件预测，最后利用TBtools进行可视化。

在BnTIR数据库（https://yanglab.hzau.edu.cn/ bntir）上下载不同组织部位的转录组数据，使用TBtools对转录组数据表达谱生成热图可视化。将采集的材料使用TRIzol（天根生化科技有限公司，北京）提取总RNA，之后使用Evo M-MLV反转录试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）合成cDNA，使用方法均参考说明进行操作。使用SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）进行qRT-PCR试验，设3次重复，每个重复的体系为15 μL（包括cDNA模板0.3 μL、上下游引物各0.6 μL、SYBR mix 7.5 μL、ddH₂O 6 μL），最后利用BIO-RAD（CFX Connect实时荧光定量PCR系统）运行程序：预变性95 °C 5 min；变性95 °C 15 s，退火60 °C30 s，循环40次；融解阶段95 °C 15 s，60 °C1 min，95 °C 15 s。使用2^-ΔΔCT方法^[21]计算相对表达量，最后利用t检验^[22]进行显著性分析，试验所用引物见表1。

结合2种鉴定方法我们一共在甘蓝型油菜全基因组水平上鉴定到了44个LPAT家族成员，按照基因在染色体出现的顺序以及同源关系，对其命名（表2）。理化性质分析（表2）发现，BnLPAT蛋白的长度为285（BnLPAT13-C）~841（BnLPAT17-A）个氨基酸，分子质量为31.79（BnLPAT6-C）~92.41（BnLPAT17-A）kDa，理论等电点（PI）为5.85（BnLPAT3-C）~9.74（BnLPAT5-C）。亚细胞定位预测表明这些蛋白质（除BnLPAT17-A外）主要定位于叶绿体和内质网。

为了获取甘蓝型油菜LPAT蛋白的系统发育关系，构建了一个来自双子叶模式植物拟南芥（Arabidopsis）、白菜（Brassica rapa）、甘蓝（Brassica oleracea）和甘蓝型油菜共88个LPAT成员的临近加入法的系统发育进化树（图1），其中拟南芥有11个LPAT成员，白菜有18个，甘蓝有15个，甘蓝型油菜有44个。结果（图1）显示，88个LPAT蛋白分为5个亚家族。其中，LPAT1亚家族成员包含18个成员，包括4个拟南芥、4个白菜、2个甘蓝和8个甘蓝型油菜LPAT成员；LPAT2亚家族有18个成员，包括2个拟南芥、4个白菜、3个甘蓝以及9个甘蓝型油菜LPAT成员；LPAT3亚家族有17个成员，包括2个拟南芥、4个白菜、3个甘蓝和8个甘蓝型油菜LPAT成员；LPAT4亚家族有25个成员，数目最多，包括3个拟南芥、4个白菜、5个甘蓝和13个油菜LPAT成员；没有拟南芥LPAT成员被划到LPAT5亚家族，此分支由2个白菜、2个甘蓝和6个甘蓝型油菜LPAT成员组成。

白菜和甘蓝中分别有18和15个LPAT成员，总和小于甘蓝型油菜LPAT成员数量，这可能是在甘蓝型油菜在进化过程中，LPAT家族部分成员发生了基因扩增事件。例如LPAT1亚家族BnLPAT5仅在白菜中发现了同源成员Bra03g032140，而在甘蓝中没有相应的同源成员；相似地，BnLPAT6和BnLPAT13在白菜和甘蓝中仅有1对同源基因BraA02g024850和Bol027465，同时如Bol030981和BraA01g034060在甘蓝型油菜中产生了3个BnLPAT2基因的拷贝，这些结果都表明甘蓝型油菜LPAT家族基因在进化中发生了由基因复制驱动的扩张；但一些基因在甘蓝型油菜进化过程中出现与白菜、甘蓝保守相同的特点，如LPAT2亚家族的BnLPAT4 2个同源基因和BraA07g022970以及Bol007598显示较为保守的进化关系。

44个BnLPAT基因不均匀地分布在17条染色体上（图2），其中A02和A06染色体上没有LPAT分布，C03染色体上分布5个LPAT基因，数量最多；其他染色体上分布着1~4个LPAT基因。基因复制事件是驱动基因家族扩张的重要动力^[23]，因此我们分析了BnLPAT基因的复制关系，共检测到20对片段复制基因对（图2），没有检测到串联复制事件的发生，这说明在BnLPAT家族扩张过程中，片段复制事件的发生是重要的驱动力。

在BnLPATs序列上总共鉴定了10个保守Motif（图3a~b），结果显示相邻分支的成员有着保守的基序组成，如在LPAT3分支上的8个BnLPAT成员的基序组成均为Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 5、Motif 6和Motif 9，此外一些基序是在特定的分支上保守出现，比如Morif 2出现在除LPAT5分支的其他分支上，Motif 3和Motif 6出现在LPAT2和LPAT3分支，Motif 8只出现在LPAT3分支上，Motif 10只出现在LPAT2分支上，这些结果暗示了不同分支的生物学功能特征可能是这些保守基序导致的。

不同分支的BnLPAT基因结构组成相似（图3c），LPAT3分支的基因内含子数目最少，由2或3个内含子组成，其他分支的BnLPAT基因组成较为复杂，内含子数目在5（BnLPAT6-A、BnLPAT6-C、BnLPAT13-A和BnLPAT13-C）~22个（BnLPAT17-A）不等。

对44个BnLPAT蛋白序列进行对比分析（图4a），确定了2个在酰基转移酶保持活性的保守结构域^[24]（NHX4D和EGTR）（图4b），除去LPAT5分支的6个成员外，其他的38个BnLPAT在NHX4D结构域（Motif 2）均显示高度保守；此外由EGTR残基组成的Motif 1也显示在LPAT1和LPAT2分支保守。

在PlantCARE数据库上提交BnLPAT基因上游2000 bp序列作为推定的启动子区域，总共鉴定到42种共1098个顺式作用元件，并根据其出现的位置将22种特异性响应元件可视化（图5）。按照响应类型将其分为4类，如Box 4和G-box等19种光响应元件共出现了524次；与生长发育相关的元件如CAT-box（与分生组织表达相关）和O2-site（玉米醇溶蛋白代谢）；与激素响应相关的元件共10种，其中ABRE元件（参与脱落酸响应）是出现次数最多的，共114次，此外如赤霉素（GA）响应元件GARE-motif和P-box以及茉莉酸甲酯（MeJA）响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif等也出现在BnLPAT启动子区域；与逆境胁迫响应相关的5种元件如ARE（缺氧诱导）出现在38个BnLPAT基因启动子区域，与干旱响应相关的元件MBS出现在21个BnLPAT基因启动子区域。上述结果说明了BnLPAT基因可能受不同的外界环境调控表达。

根据BnTIR数据库上ZS11转录组数据，绘制BnLPAT基因表达谱热图（图6a），44个基因中除BnLPAT6-C、BnLPAT15-A和BnLPAT15-C外的41个基因在6个组织中均有表达。其中BnLPAT1-C、BnLPAT4-A、BnLPAT4-C、BnLPAT19-A、BnLPAT19- C、BnLPAT20-A、BnLPAT20-C和BnLPAT22-C在根、茎、叶、花、种子和角果中均有较高的表达量，BnLPAT1-A、BnLPAT14-A和BnLPAT14-C在种子中有较高的表达，BnLPAT10-A和BnLPAT10-C在根和茎中高表达，BnLPAT16-A和BnLPAT16-C在叶和角果中高表达。

研究^[25-26]表明LPAT成员在植物脂肪酸积累方面发挥着重要作用，甘蓝型油菜是以种子为收获目的的油料作物，因此我们根据表达谱对ZS11种子发育过程中7个时期的11个种子高表达基因以及种子低表达基因BnLPAT12-A进行了qRT-PCR试验（图6b）。4个基因（BnLPAT1-A、BnLPAT1-C、BnLPAT14-C和BnLPAT19-A）整体上随着种子发育的完全，其表达量呈现上升趋势，3个基因（BnLPAT12-C、BnLPAT14-A和BnLPAT19-C）的表达随着种子发育呈现下降趋势，此外BnLPAT4-A和BnLPAT20-C的表达先下降后上升，BnLPAT4-C、BnLPAT19-C和BnLPAT20-C在花后0 d表达量最高，BnLPAT22-C在花后35 d表达量最高。

进一步于花后28和35 d在3个含油量不同的材料中检测了BnLPAT1-A、BnLPAT1-C、BnLPAT14-C和BnLPAT20-C这4个在种子发育过程中上调的基因表达特点。结果如图7所示，在花后28和35 d时，BnLPAT14-C在含油量高的品种ZS11中的表达量显著高于含油量中、低的品种；BnLPAT1-C在花后35 d时在ZS11中的表达量高于其他2个品种；BnLPAT19-A在28 d时在3个品种中表达量差距不大，但在35 d时在ZS11中的表达量显著高于其他2个品种。除BnLPAT1-A外的3个基因在花后28或35 d均表现出在高油材料背景下表达上调的特点，可见这3个基因参与了油菜种子脂肪酸的积累。

研究脂肪酸合成与代谢相关的基因一直是油料作物的热点，研究^[9]表明LPAT家族成员在脂肪酸的积累方面起到调控作用，如在拟南芥中过表达甘蓝型油菜BAT1.13（本研究中的BnLPAT19-C）和BAT1.5（BnLPAT4-C）提高了转基因拟南芥种子含油量，而这2个基因在种子中高表达。在拟南芥中过表达酵母LPAT基因SLC1提高了转基因株系的含油量^[27]，在烟草中过表达紫苏PfLPAT2提高了叶片的含油量^[28]。截至目前，已经在许多植物全基因组水平上鉴定到LPAT成员，但在油料作物甘蓝型油菜中尚未有系统性的研究。在本研究中，在全基因组水平上共鉴定到了44个BnLPAT成员，并分析基因结构、保守基序、顺式作用元件和组织表达模式以及种子发育过程中的表达。

按照系统发育关系，44个BnLPAT被分为5个分支，其中LPAT5分支的6个BnLPATs较AtLPATs同源关系较远，同时基因结构、保守基序也暗示了这些BnLPAT蛋白可能具有不同于拟南芥LPAT成员的生物学功能，其余4个分支的LPAT在进化中保守。有研究^[29]表明，质体型AtLPAT1（本研究中命名为AtLPAT10）与胚胎发育相关，AtLPAT1定位在叶绿体中，atlpat1突变体出现胚胎致死的现象，BnLPAT20的2个同源基因和AtLPAT1有着较近系统发育关系，并且BnLPAT20-A和BnLPAT20-C在种子高表达，因此推断这2个基因可能也在胚胎发育中发挥功能。

基因家族是由某些古基因经过复制产生2个或者以上的拷贝而构成的一组基因^[30]，基因复制事件大部分由串联复制和片段复制组成^[31]。构成甘蓝型油菜BnLPAT基因复制事件均发生在染色体不同区域而被认定为片段复制^[32]，这可能是虽然甘蓝型油菜基因组远小于棉花基因组，但LPAT成员数目仍然大于棉花LPAT成员数目，也是导致BnLPAT数目大于白菜和甘蓝LPAT数目的原因，如在LPAT4分支中，BnLPAT基因数目分别是白菜和甘蓝LPAT基因数目的3.25和2.60倍。基因结构、保守基序和序列比对结果表明，相邻分支的BnLPAT成员在进化中较为保守，这些结果暗示了这些基因可能具有相似的生物学功能。先前的研究^[11,33]表明，除调控脂质物质的合成代谢外，LPAT还在育性、抗逆性以及膜重构方面发挥作用，例如在低温环境中拟南芥fab1突变体不能维持正常的光合作用，这是由于fab1突变体在低温下高熔点的磷脂酰甘油含量以及膜脂中16:0脂肪酸含量增加导致低温损伤^[34]；在白念珠菌（Candida albicas）中过表达LPT1基因，当提供棕榈酸时，膜磷脂表现为不均匀分布^[35]；此外过表达LPAAT3通过改变磷脂和溶血磷脂抑制了高尔基体膜小管的形成^[36]。大量顺式作用元件被鉴定到存在BnLPAT基因启动子区域，比如在LPAT5分支上的成员BnLPAT16-C存在10个ABRE元件，BnLPAT9-U存在8个LTR元件，暗示这2个基因表达可能分别受脱落酸以及低温胁迫的调控，从而在不同环境下发挥生物学功能。

基因的表达模式与其功能密切相关，转录组表达分析表明，不同分支的BnLPAT具有特异性的表达特点，例如LPAT1分支多数成员表达不高，LPAT2分支的4个成员在不同的组织均有较高的表达量，LPAT3分支的成员在茎中有着相对较高的表达，LPAT4分支成员在根、茎、叶和种子有相对较高的表达量，而LPAT5成员在叶和角果中表达最高。植物根部往往最先响应胁迫信号，根特异表达的基因通常和逆境适应相关，因此LPAT4分支的成员可能在抗逆适应发挥功能。11个在种子高表达的基因，有4个（BnLPAT1-A、BnLPAT1-C、BnLPAT14- C和BnLPAT19-A）随着种子的发育其表达量逐渐升高。有研究^[37]表明，油菜种子中脂肪酸的积累也是随着时间的增加而增加，在35DAF左右脂肪酸含量达到最大，随后脂肪酸合成达到稳定。因此，我们在3个含油量不同的材料中检测了这4个基因的表达量，其中3个基因在28或者35 DAF时，高含油量的品种基因表达水平显著高于其他2个品种的表达水平。这些结果暗示了这3个基因可能在油菜种子脂肪酸积累方面发挥功能。总之，甘蓝型油菜LPAT基因家族表达模式分析能为进一步研究其生物学功能提供线索。

甘蓝型油菜高质量基因组的组装发布以及高效遗传转化体系的建立为油菜分子育种提供了可能，而利用转基因或者基因编辑手段对调控油脂合成通路基因进行干预从而获得高品质油菜种质方兴未艾，但是在全基因组水平对油菜脂肪酸合成关键基因家族LAPT的鉴定尚未见报道。此项研究在鉴定BnLPAT家族成员的基础上进行了分类，并开展了系统的生物信息学相关分析，同时利用转录组数据以及qRT-PCR技术研究了BnLPAT基因的表达模式，初步明确了在脂肪酸合成过程的关键基因。