马铃薯是我国第四大粮食作物，种植面积及总产量居于世界首位^[1]，然而，高肥低效是目前作物生产中需要迫切解决的问题，且其吸收和利用效率因品种而异。因此，提高马铃薯对氮素的吸收和利用效率是当前农业研究的重要方向之一^[2]。硝酸盐是植物可利用的主要氮源之一，其吸收和转运主要由硝酸盐转运蛋白家族（NRT）介导。其中，高亲和性硝酸盐转运蛋白家族（NRT2）在氮匮乏条件下对植物氮素吸收和再分配中发挥着关键作用^[3]。

近年来，NRT2家族基因在多种植物中的功能研究已取得显著进展，在拟南芥中，AtNRT2.1和AtNRT2.2已被证实参与硝酸盐的高亲和性吸收^[4]，并在氮素缺乏条件下表现出显著的上调表达，AtNRT2.5在根部和成熟叶片中表达^[5]，在缺氮条件下能够调控硝酸盐的吸收和转运；在农作物中，NRT2家族基因的研究也逐渐深入，如小麦^[6]中的TaNRT2.1和玉米^[7]中的ZmNRT2.1均被证明对氮素吸收和利用效率有重要影响，ZmNRT2.1与NAR2蛋白相互作用后在硝酸盐的吸收途径中起主要作用^[8]，且主要在根部表达。然而，目前对StNRT2.5在马铃薯中的表达模式及具体功能研究较少，尤其是其在氮素吸收和利用中的作用机制尚不明确。

基于以上问题，本研究以30个不同马铃薯品种为材料，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了StNRT2.5在不同品种中的表达模式，并结合生物信息学分析对其保守结构域、系统发育关系及启动子元件进行了综合分析，旨在揭示StNRT2.5在不同马铃薯品种中的表达差异及其与氮素利用效率的关系，同时为深入理解StNRT2.5的功能及其在氮素吸收中的作用机制提供理论基础。此外，本研究也为马铃薯氮素利用效率的遗传改良提供了重要的参考依据，具有重要的理论和实践意义。

30个马铃薯材料（表1）由吉林农业大学园艺学院马铃薯创新团队提供。选用MS基础培养基（主要氮源KNO₃ 1.9 g/L、NH₄NO₃ 1.65 g/L），每瓶培养基扦插5株苗，每个处理10瓶。培养条件为光照强度6000 lx，光照时间14 h，温度25 ℃，湿度40%~60%的光照恒温培养箱中，21 d时采集30份马铃薯材料的叶（L）和根（R），重复3次，液氮冷冻后保存至-80 ℃冰箱。

30份马铃薯材料分别提取根、叶RNA，反转录成cDNA后进行qRT-PCR。总RNA提取及cDNA合成：用TransZol Up Plus RNA Kit高纯度RNA提取试剂盒（ER501，北京全式金生物技术股份有限公司）提取马铃薯品种大西洋根和叶的总RNA，并用TransScript^® All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR反转录试剂盒（AU341，北京全式金生物技术股份有限公司）合成cDNA。

采用SnapGene软件设计qRT-PCR-StNRT2.5引物，内参基因引物EF1α由马铃薯创新团队提供，由吉林省生工生物有限公司合成。引物序列为：EF1α-F：GATGGTCAGACCCGTGAACA；EF1α-R：CCTTGGAGTACTTCG GGGTG^[9]。荧光定量PCR按照Prime Script™ RT Master Mix（Perfect Real Time）试剂盒（北京全式金生物技术股份有限公司）说明书进行操作，反应体系（20 μL）：TB Green Premix Ex Taq 10.0 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2.0 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，ddH₂O 6.0 μL。qRT-PCR反应程序：预变性95 °C 30 s；变性95 °C 5 s，退火60 °C 30 s，40个循环；95 °C 15 s，60 °C 1 min，95 ℃ 15 s。通过熔解曲线确认引物特异性，进行表达水平分析，将平均Ct值相对于内参归一化。采用2^-∆∆Ct的方法进行分析，设置3次生物学重复。

基因筛选：参照课题组数据库中基因功能注释，筛选出StNRT2.5（LOC102586376），通过NCBI上进行BLAST比对，对序列进行分析，确定ORF框。RNA提取与cDNA合成：利用RNA提取试剂盒（ET111，北京全式金生物技术股份有限公司）提取马铃薯品种大西洋全株的总RNA，并使用反转录试剂盒（R312，北京全式金生物技术股份有限公司）合成cDNA第一链。PCR扩增：使用SnapGene 6.0.2设计特异性引物（StNRT2.5-F：ATGGAAA ACATGGATTTGGAATC；StNRT2.5-R：TATATTAG GAGTTCCATCTATAGGTG），进行目的片段PCR扩增，PCR产物回收纯化（EG101，北京全式金生物技术股份有限公司）。载体连接与转化：与TA/Blunt-Zero Cloning Kit载体（C601，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）连接，将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α（ZC101，北京庄盟国际生物基因科技有限公司）中，进行菌液PCR检测，具体操作方法参照说明书。鉴定正确的重组质粒送公司测序。生物信息学分析（表2）参考韩祉君等^[10]的方法。

根据StNRT2.5在不同马铃薯中的表达模式（图1），可以将30份马铃薯分为2类。一类是叶部表达量高于根部的品种，共有20份，包括隆丰黑美人、克新33号和长崎等，与延薯4号对氮素响应的转录分析一致^[11]；另一类是在根部表达高于叶部的品种，其中龙薯25号差异最显著。不同品种中StNRT2.5表达模式不同，使得在氮素吸收、转运和再分配过程中存在差异，影响其对氮素利用效率。在氮高效型马铃薯品种青薯和克新系列^[12]中，StNRT2.5在叶片中维持较高表达，表明其在氮素的转运与再分配可能更为高效；而在氮低效型品种大西洋中，StNRT2.5在根部的表达量高于叶片，表明根系对氮素的代偿性吸收尝试，但氮素向地上部的转运与再分配受到限制，导致氮素无法被有效利用，从而表现为低氮利用效率。

以马铃薯品种大西洋的cDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，得到大小约为1500 bp的序列（图2）。经测序，该片段大小为1512 bp。

ProtParam蛋白理化特性分析（表3）表明StNRT2.5编码的蛋白质由503个氨基酸组成，ProScale预测结果（图3a）显示其为疏水性蛋白，TMHMM氨基酸跨膜结构预测（图3b）显示其跨膜结构域的数量为11个；SignalP（图3c）显示其不具有信号肽；Net Phos 3.1 Server（图3d）显示StNRT2.5蛋白序列中存在47个氨基酸残基，这些氨基酸残基会引起蛋白结构和活性的变化，是其行使功能的重要前提之一。

蛋白结构域搜索结果显示StNRT2.5蛋白同源超家族为MFS transporter（图4a），具有6个保守结构域，且均属于Nitrate transporter蛋白结构域，因此确定其为高亲和性硝酸盐转运蛋白。利用SOPMA预测StNRT2.5蛋白质二级结构，结果（图4b）显示StNRT2.5含有3种二级结构，其中α-螺旋占比最高。Swiss-Model三级结构分析（图4c）显示，StNRT2.5氨基酸序列与模板（AlphaFold DB model of A0A2Z7B1D0_9LAMI）覆盖率为80.24%，GMQE值为0.89。The BAR结果（图5）显示，eStNRT2.5在马铃薯根、叶与块茎中均有表达，且主要在叶片中表达。利用UniProt进行亚细胞定位预测，结果（图6）显示其定位在细胞膜中，因此推测StNRT2.5在细胞膜中行使其功能。

对NRT2.5基因启动子区域（转录起始位点上游2000 bp）的顺式作用元件分析（图7）显示，该区域包含多种功能元件，涵盖光响应（如G-box、Box 4和LTR）、激素响应（如ABRE、ARE、CGTCA-motif和TCT-motif）、胁迫响应（如TC-rich repeats和CAAT-box）及基础转录调控（如TATA-box和CAAT-box）等类别，同时存在AE-box、A-box和AT-rich element等可能参与组织或发育特异性调控的元件。这些元件在启动子序列上的分布表明，NRT2.5基因的表达可能受光信号、多种植物激素及胁迫因素的综合调控，其启动子区域具有复杂的转录调控网络。氨基酸多重序列比对以拟南芥为参照，结果（图8）显示，利用NCBI-BlastX将StNRT2.5进行比对后使用MEGA软件构建StNRT2.5系统进化树，StNRT2.5与原始栽培的二倍体马铃薯（Solanum stenotomum）和多疣茄（Solanum verrucosum）中的StNRT2.5具有较高同源性，进化关系较为接近。

通过STRING数据库的分析，StNRT2.5蛋白被预测与多个已知的硝酸盐转运相关的基因存在互作关系。这些互作蛋白在氮代谢中发挥重要作用，可能与StNRT2.5的高亲和性转运功能形成协同作用。为了进一步验证这些互作关系，选择NIA2（硝酸还原酶，NR）和StNRT3.1作为目标互作蛋白，并与StNRT2.5进行蛋白互作预测（图9）。

利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析互作蛋白（StNR和NRT3.1）在不同品种和组织部位（根、叶）中的表达水平。qRT-PCR结果显示，StNR（NIA2）在马铃薯根与叶中均有表达（图10），但在叶片中的表达上调更为显著；StNRT3.1则主要在马铃薯根系中高表达（图11），其表达模式与根系作为氮素吸收的主要部位的功能一致，StNRT3.1与NRT2家族成员的互作是其功能发挥的关键，是CHATs中使不含硝酸盐的根能够吸收N离子的主要贡献者^[13-14]。

高亲和性硝酸盐转运蛋白家族（NRT2）在氮匮乏条件下对植物氮素吸收和再分配中发挥着关键作用。30个马铃薯品种表达模式分析结果表明，StNRT2.5在不同品种中的表达存在组织差异性。主要可分为2类：一类是在叶片中高表达，推测其与AtNRT2.5在成熟叶片中表达一致，主要参与叶片中硝酸盐的再利用过程；另一类是在根部高表达，推测其与ZmNRT2.1与NAR2蛋白相互作用后表达一致，主要参与根部对硝酸盐的吸收过程。因此，经分析可知，StNRT2.5在根部的高表达有助于增加根部对氮素的吸收能力；而在叶片中高表达则有助于氮素从根部转运到地上部，在植株体内进行重新分配来满足不同组织器官对氮素的需求^[15-18]。

生物信息学分析结果显示，StNRT2.5蛋白为稳定、疏水性蛋白。氨基酸序列比对结果表明，StNRT2.5基因编码的氨基酸序列含有MFS保守基序（MFS:G-XXX-D-XX-G-X-R）和硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白家族NNP保守基序（NNP:G-W/L-G- N-M/A-G），与硝酸盐转运蛋白NRT2基因家族的结构高度相似，说明StNRT2.5具有NRT2基因家族成员特征。启动子元件分析揭示了StNRT2.5启动子区域含有多种作用元件，这些元件的存在为StNRT2.5的研究提供了潜在的分子机制基础，并暗示该基因可能受到氮素信号和植物激素的协同调控。系统发育分析表明，StNRT2.5与原始栽培的二倍体马铃薯和多疣茄具有较高同源性，这一结果支持了StNRT2.5在进化上的保守性，表明其在不同茄科植物中可能具有相似的生物学功能。

为了进一步验证StNRT2.5的功能，通过STRING数据库的分析，选择了StNR（NR）和StNRT3.1作为互作蛋白，并对其进行了蛋白互作预测及表达模式分析。结果表明StNR在叶片中表达更显著，其表达模式和受到基因型的显著影响，StNRT2.5与StNR的互作关系可能有助于将吸收的硝酸盐高效转运至叶片进行代谢，从而促进马铃薯植株的整体氮素利用效率^[19]；StNRT3.1在根系中高表达，与根系作为氮素吸收主要部位的功能相一致^[20]，且StNRT2.5与StNRT3.1的互作关系可能在硝酸盐的吸收过程中发挥关键作用，这种互作关系对于提高氮素吸收效率至关重要。本研究通过StNRT2.5的表达模式分析揭示了其在不同马铃薯品种和组织部位中的表达差异，并通过生物信息学分析揭示了StNRT2.5的保守结构域、进化关系以及启动子元件特征，为理解该基因在氮代谢过程中的调控机制研究提供更多参考，并利用STRING数据库分析预测了StNRT2.5与StNR、StNRT3.1的互作关系，为理解该基因在马铃薯氮素吸收中的功能提供了重要线索。这些结果不仅为后续的功能验证和分子机制研究奠定了基础，也为马铃薯氮素利用效率的遗传改良提供了理论支持。

StNRT2.5的表达在不同品种中存在组织差异性，主要可分为2类：一类是在叶片中高表达，另一类则是在根部高表达；StNR在叶片中表达上调；StNRT3.1则主要在根系中表达。生物信息学分析表明StNRT2.5由503个氨基酸组成，为稳定、疏水性蛋白，具有典型的硝酸盐转运蛋白家族保守结构域，且StNRT2.5与原始栽培的二倍体马铃薯和多疣茄具有较高同源性。