小麦（Triticum aestivum L.）作为我国农业发展的重要作物之一，不仅是主要的粮食作物，还在全球贸易中占有重要地位，对保障我国粮食安全和促进农产品贸易具有重要作用。《中华人民共和国种子法》[1]规定主要农作物品种在推广应用前应通过国家或者省级审定，配套实施的《主要农作物品种审定办法》[2]明确要求品种获得审定需完成同一生态区2年区域试验和1年生产试验，但第1年区域试验综合性状突出的品种可同时参加第2年区域试验和生产试验。在区域试验环节中对参试品种进行疑似品种筛查，以及真实性、品种纯度和DNA位点纯合率等项目检测，可有效遏制低世代品系参试、不同年度或区组更换品种、使用已审定品种冒充参试、一品多名重复申请审定、以劣质品种冒充优质品种参试等现象发生，从而提升审定品种的整体水平。传统的品种鉴定主要依靠田间表型鉴定或醇溶蛋白法，其中传统田间测试不仅周期长且易受环境干扰，加之疑似品种筛查和真实性检测涉及大量已知审定品种及多渠道参试样品，跨越不同年份和区组，使得田间相邻种植鉴定和跨年度、跨区组比对变得尤为困难。醇溶蛋白法虽具备速度快、成本低和操作简便等优势，但其多态性不足、准确性欠佳且通量有限。以上2种方法给管理者带来了巨大挑战，但DNA指纹技术的出现有效地解决了以上问题。
DNA指纹是指具有完全个体特异的DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上的差异），因其个体识别能力足以与手指指纹相媲美而得名。不同品种农作物的基因组存在着能够世代稳定遗传的序列长度、碱基组成和排列方式差异，这种差异可以通过从抽取有代表性的检测样品中提取DNA，用特异引物（探针）进行扩增和基因分型（测序），从而通过其基因型（序列）的不同而加以区分。以简单重复序列标记（simple sequence repeats，SSR）和单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphism，SNP）为代表的DNA指纹检测技术因具备共显性、在基因组上均匀分布、准确性高、重复性好、通量高、易实现自动化和检测周期短等优点，相继被国际植物新品种保护联盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV）、国际种子联盟（International Seed Federation，ISF）和国际种子检验协会（International Seed Testing Association，ISTA）推荐作为作物品种鉴定和指纹数据库构建的优选标记。我国也陆续开展了玉米（Zea mays L.）[3
小麦区域试验中，通过构建参试品种与已知审定标准样品的DNA指纹图谱，能够迅速且准确地识别出不良现象及违法行为，从而为品种区域试验和审定等环节提供坚实的科技保障。这些结果可直接作为淘汰不合格品种、继续试验或推荐审定的关键依据。我国从2004年开始启动小麦区域试验品种真实性、疑似性、品种纯度和DNA位点纯合率等DNA指纹技术的研究和检测工作[32]，较玉米[33]和水稻[8]稍晚。经过20年的发展，DNA指纹技术日益成熟和完善，小麦区域试验的检测规模持续扩大，检测项目不断增加，检测能力显著提升，有效保证了品种真实性、特异性和纯度等。截至2024年，已经累计检测国家及各省、市的区域试验或联合体样品1.6万余份，并构建了区域试验和审定品种DNA指纹数据库，为小麦区域试验管理提供了有力的技术支撑。全面梳理DNA指纹技术的研究进展，并深入探究其在小麦品种区域试验中的应用，不仅有助于推动该技术的进一步发展，还能为小麦品种管理和育种实践以及其他作物DNA指纹技术的研发提供重要的理论依据。
1 小麦DNA指纹技术研究
1.1 DNA指纹技术研究思路
近二十年来，研发单位以快速、稳定和准确为目标，以市场需求为导向，开展小麦品种DNA指纹检测技术的研发。总体思路分为4个部分，第1部分为理论基础研究，包括鉴定模式、平台选择、位点确定、取样策略、非纯合位点判断、位点纯合率与稳定性和一致性的关系、指纹构建方法、数据采集方式、数据记录方法、鉴定意见确定、分子与表型一致性等。值得注意的是，小麦作为多倍体作物，与二倍体作物不同，准确、有效且快速的基因分型是瓶颈，因此创新性地提出了多倍体作物在进行位点筛选时，应筛选单拷贝位点。第2部分聚焦于理论技术化研究，涵盖了DNA指纹检测技术体系的搭建、标准样品库DNA指纹的构建，以及DNA指纹数据库管理系统的开发等方面。第3部分是技术标准化，包括与现行检测方法比较、多平台验证、内外部实验室验证、建立真实性、特异性、品种纯度和DNA位点纯合率等相关标准。第4部分是技术方法的推广应用，包括在品种区域试验监测、市场监管、品种权保护、种子认证、司法鉴定和粮食贸易等领域的大规模应用。
1.2 DNA指纹技术研究历程
1.3 SSR和SNP指纹检测技术比较
SSR是目前我国验证最充分、技术最为成熟且应用最广泛的DNA指纹技术。较SNP具有区分能力强（目前多态性最高的一种分子标记）、仪器成本相对较低、样品灵活度高、操作方便、实用性强和易推广等优点，但其缺点为位点检测通量较低（普通聚丙烯酰胺凝胶电泳通量最多可达2重，毛细管电泳最多可达11重），适合少量位点的检测，难以实现成千上万个SSR同时检测的需求。在实践中，可采用低通量检测平台（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和中通量检测平台（毛细管电泳）开展品种真实性验证、疑似品种筛查、品种纯度和DNA位点纯合率检测。SNP一般为二态分子标记，较SSR具有数据统计简单准确、数据兼容性强、易于共享、流程易于自动化和规模化以及兼容多平台等优势，然而，其不足之处在于单个位点对品种的区分能力较弱。在实践中，可采用低通量位点检测平台[如实时荧光定量PCR和竞争性等位基因特异性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）等]开展品种真实性身份验证和纯度检测工作；采用高通量位点检测平台（以SNP芯片技术为主，一次性可检测万级以上的SNP位点）开展品种真实性身份鉴定、特异性和实质性派生品种鉴定。SSR和SNP检测技术具体见表1。SSR和SNP各有优劣势，应针对不同的应用场景选择不同的指纹技术开展品种鉴定工作。
表1 SSR和SNP检测技术的比较
Table 1
| 项目Item | SSR | SNP |
|---|---|---|
| 检测平台Detection platform | 聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳 | 实时荧光定量PCR、竞争性等位基因特异性PCR和芯片等 |
| 检测通量Detection throughput | 低、中 | 低、中、高 |
| 仪器成本Instrument cost | 10万~300万元 | 50万~1000万元 |
| 检测成本Testing cost | 1~2元/数据点 | 0.001~0.800元/数据点 |
| 技术优势Technical advantage | 品种区分能力强、设备成本低、易于推广 | 自动化和规模化程度高、数据易统计共享 |
| 技术劣势Technical disadvantage | 位点通量低 | 单个位点区分能力较弱 |
| 应用领域Application area | 少/中量样品、少量位点检测 | 中/大量样品或中/大量位点集中检测 |
| 应用方向Application direction | 真实性身份验证、特异性筛查和DNA位点纯合率检测等 | 真实性身份验证、真实性身份鉴定、特异性筛查、实质性派生性品种鉴定和纯度检测等 |
2 DNA指纹检测技术在小麦区域试验中的应用
2.1 小麦区域试验DNA指纹检测
2.1.1 检测规模持续扩大
2004年农业农村部率先在冬小麦区域试验中引入指纹检测，2010年该检测范围扩展至春麦品种。2008年起逐步将检测范围由国家扩大到河北和北京，2009年扩大到河南和江苏，2010年扩大到湖北和黑龙江，2016年扩大到山西，2017年扩大到四川和陕西，2019年扩大到天津，2021年扩大到山东、安徽和重庆，2022年扩大到宁夏、内蒙古和甘肃，2023年扩大到西藏。截至目前，至少有17个省、市和区开展小麦DNA指纹检测，基本实现了我国小麦区试品种DNA指纹检测的全覆盖。
图1
2.1.2 检测项目不断增加
在小麦区域试验DNA指纹检测中，一致性和稳定性检测主要检测参试品种的品种纯度和DNA位点纯合率；特异性检测主要检测参试品种与已知审定品种是否具有特异性；真实性检测主要检测参试品种在不同年份或区组有无更换种子。从检测项目看，2004年仅做纯度检测，2005年开始做疑似品种筛查、真实性和品种纯度检测，2006年技术基本完善，开始做疑似品种筛查、真实性、品种纯度和DNA位点纯合率检测。由于审定保护统一，一致性和稳定性鉴定放入DUS测试中心，自2015年起检测项目恢复为真实性检测和疑似品种筛查。在检测力度上，2024年开始由以前的各个试验渠道检测转变为国家统一试验、国家良种联合攻关试验、国家联合体试验、自主试验和绿色通道的联合检测；2023年以前，申请审定品种与已知品种DNA指纹检测遗传相似系数大于0.900（差异位点数≤3）时，进行田间测试；但从2024年开始，申请审定品种与已知品种DNA指纹检测差异位点数=3时，需进行田间小区种植鉴定以证明有重要农艺性状差异，差异位点数≤2时直接淘汰。
2.1.3 检测能力显著提升
2004年启动小麦区域试验工作时，采用的是SSR标记技术，但当时的检测平台仅有变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（垂直板电泳技术），构建指纹图谱时需每对引物各等位变异的代表样品，对制胶人员能力要求高，过程复杂繁琐，时效差且准确性低。至2011年，建立了多重毛细管电泳高通量检测平台，构建指纹图谱时仅需1~2个参照样品，无需制胶，且每个样品孔可实现多重产物检测，检测通量和效率提高了6~11倍，自此小麦指纹检测进入SSR高通量检测时代，并沿用至今。随着2022年SNP指纹检测技术标准的颁布，样本和位点检测通量进一步提升，仅需数天即可高效完成1536份样品的指纹图谱构建，相较于SSR毛细管检测平台，其检测通量和效率实现了数百倍的提升，为小麦区域试验监管提供了有效的技术支撑。
2.1.4 检测效果逐步显现
从真实性检测项目来看，更换样品主要是选育单位的主观行为，因此指纹检测效果比较明显。分析2014-2023年国家区域试验参试样品的真实性检测情况（图2），问题品种平均占比1.77%，变化范围在0.00%~5.00%。年度间差异较大，其中2014年问题品种占比最大（5.00%），2016、2018和2020年未检测出问题品种。整体上看，近8年问题品种数量比之前减少较多，呈现偶然现象。从更换类型上来看，由差异较大的品种更换转为同一组合不同后代的更换以及高度相似姊妹系的更换，不同年份间更换转向不同区组更换或不同试验渠道的更换，以及已审定品种参加其他区域试验时同名更换等。
图2
图2
国家区试中检测出的疑似品种和问题品种占比情况
Fig.2
Proportions of approximate and problematic varieties detected in national regional trials
在疑似品种筛查项目中，疑似品种的检出能力得到了显著提升，从而进一步控制了育种的同质化现象。分析2014-2023年国家区域试验参试样品的疑似品种筛查情况（图2），筛查出有疑似品种平均占比18.85%，变化范围在9.09%~25.00%。年度间差异较大，其中2018年筛查出的疑似品种数最多，占比25.00%，2022年最少，占比仅为9.09%，与前几年相比有明显下降，已跌至10.00%以下的水平。分析疑似品种产生的原因，主要包括同一单位育成的多个品种参与试验、同一单位将同一组合的姊妹系通过不同渠道进行参试以及将同一组合转让给多家单位并以不同名称进行参试等情况。随着后期全国参试品种指纹数据库联网，这种情况将逐步减少；并且在主要推广品种和核心骨干基础上开展诱变育种或提纯系选等（“修饰性育种”），形成新品种参试；以主要推广品种和核心骨干为亲本，采用回交或者系统选育的方式开展育种（“模仿育种”），形成新品种参试。
从品种纯度和DNA位点纯合率检测项目来看，共持续检测了10年，整体效果较好。品种纯度主要是由于机械混杂引起，DNA位点纯度主要是因为遗传未稳定造成。共检测出品种纯度和DNA位点纯合率较差的品系120个，后3年检测出的问题品系相对较少，DNA指纹检测技术的引入对低世代不稳定材料的提前参试形成了明显的遏制作用。
2.2 小麦区域试验品种的遗传基础分析
DNA指纹检测技术可有效揭示小麦区域试验品种的遗传基础、了解我国小麦的育种水平和发展趋势等。DNA指纹检测单位前期分析了2009-2014年参加国家冬小麦区域试验的430个品系的遗传多样性和群体结构[39]，结果表明平均基因多样性和多态性信息量分别为0.73和0.70；从不同年份分析，参试材料的遗传多样性从2012年开始略有下降；从不同生态种植区域分析，参试品系的遗传多样性自北向南（北部冬麦区组至长江流域冬麦区组）呈明显下降趋势；聚类、主坐标和群体结构分析均表明长江上游和长江中下游组的参试品系与其他区组的参试品系明显分开，且分别归属于不同亚类，显示出独特的生态区域类型；群体结构分析结果揭示71.9%的参试品系群体结构比较单一，其中长江流域组的参试品系最为单一。为了提升小麦区域试验品系的遗传结构，我们应积极促进国内外种质交流，引入优异基因，同时利用各种先进的育种手段进行改良，以拓宽其遗传基础。同时，DNA指纹检测单位也分析了2009-2015年北京参试品种的遗传多样性[40]，结果显示，小麦参试品系的平均多态性信息含量和平均基因多样性分别为0.69和0.73。总体上北京市参试品系不同年度间的遗传多样性无明显变化，说明近些年北京区域试验品系在育种资源、育种模式以及育种方向上变化较小。
3 问题与展望
3.1 加强不同区域试验渠道之间的协调
同一渠道内真实性问题品种检出数量有限，然而，国家和省际间的问题品种却日益增多。针对不同渠道间真实性问题的品种，需国家与各省管理部门协同合作，出台统一的管理措施，确保对同一品种处理结果的一致性。
同一渠道内参试品种之间以及参试品种与标准样品指纹进行比较，发现疑似品种时（品种间遗传相似系数大于0.900），可根据品种参试的先后顺序确定原始品种或者特异性，处理起来比较简单。但当不同渠道的参试品种间出现疑似现象时，如何确定原始品种显得较为困难。另外在进行不同渠道参试品种的指纹比对时，由于存在送样时间不一致的问题，如果不掌握好比对顺序和范围易导致部分疑似品种漏检。即使同步送样，在构建好指纹数据库后，如果不把握好指纹比对顺序（如国家试验优先级高于省市试验，统一试验高于联合体和绿色通道试验等），同样导致部分疑似品种漏检。这些问题需要国家和各省级管理部门联动，制定管理办法，加大国家联合体、联合攻关、国家区域试验以及省级区域试验的联动检测，规范送样时间，按照一定的顺序原则进行比对，防止相似品种在不同渠道审定。
3.2 解决参试品种趋同化严重的问题
我国研发出来的品种鉴定专用标记，无论是低密度的SSR标记，还是高密度的SNP标记均展现出卓越的分辨能力，能够区分大多数品种，但仍有少数品种呈现相似性。如分析2014-2023年筛查出的疑似品种，约占参试品种的20%，说明参试品种与已知审定品种趋同化比较严重，原始创新力度不够大，高效鉴别同质化严重的品种已成为品种鉴定工作中的重点和难点。2021年12月修订《中华人民共和国种子法》[1]增设了实质性派生品种制度，为激励和保护原始创新以及加强种业知识产权保护提供了重要的法律保障。建立快速、准确且科学的小麦实质性派生品种指纹鉴定技术标准是确保我国小麦种业创新不可缺少的技术保障。
3.3 提高品种审定门槛
在区域试验样品实际检测过程中，当筛查出近似品种后，管理部门处理方式经历了5个阶段。第1个阶段是2010年前的初期研发阶段，对DNA指纹检测与现有品种遗传相似系数≥0.950，且田间未观察到明显差异的续试品种进行田间比对，决定参试品种是否具有特异性。第2个阶段是2010-2017年，对DNA指纹检测与现有品种遗传相似系数>0.900，且田间未观察到明显差异的续试品种进行密码编号后，进行疑似品种田间相邻种植鉴定，组织小麦品种审定委员会在田间进行盲评，决定参试品种是否具有特异性。第3个阶段是2017-2022年，由于审定保护统一，疑似品种不再进行田间种植鉴定，而是由试验组织单位统一向农业农村部科技发展中心提供疑似品种清单及疑似品种种子样品，并通知育种单位自行联系进行DUS测试，育种单位在品种完成试验程序后及时提交DUS测试报告。第4个阶段是2023年，由于DUS测试中特异性关注的是生物学性状上的显著差异，不适用于品种审定（更关注经济性状）制度，要求对DNA指纹检测与现有品种遗传相似系数>0.900的疑似品种进行田间相邻种植，并制定了适宜品种审定的鉴定方案。第5个阶段是2024年至今，面对审定品种的同质化问题，国家农作物品种审定委员会更新了《国家级小麦品种审定标准（2024年修订）》[41]，新标准规定申请审定的品种必须与已知品种在DNA指纹检测上至少有4个差异位点；若差异位点数为3个，则需通过田间小区种植鉴定来证明存在显著的农艺性状差异。若品种与已知品种的DNA指纹检测差异位点数不超过2个，则该品种将被直接淘汰。这一措施显著提高了审定过程的创新性门槛，有效防止了缺乏创新性的品种通过审定。由于目前指纹检测单位在开展国家级区域试验的近似品种筛查时，纳入疑似品种比对范围的品种为小麦审定品种和同年国家级试验参试品种，未延伸至所有参试品种，存在同质化品种分别参加不同级别试验渠道的现象，直接导致部分同质化品种进入审定程序，建议除了修订规定差异位点的要求外，还应将国家区域试验筛查近似品种的比对范围扩大至小麦审定品种和所有区域试验品种，防止过多缺乏创新性的品种通过审定，提高品种审定门槛。
3.4 加强参试品种一致性的监控
品种纯度和DNA位点纯合率是决定小麦品种一致性的重要因素。分析每年区域试验样品的DNA指纹数据，发现DNA位点纯合率低于90%的参试品种占5%~10%。位点纯合率低的参试品种存在严重的性状分离现象，导致其他育种家能轻易通过提纯复壮手段筛选出新品种，这不利于原始品种权的保护，同时也给市场监管和司法鉴定工作带来了诸多困难。因此，为了保护育种者的品种权，建议小麦品种高世代参试。
分析每年区域试验样品的DNA指纹数据，发现品种纯度低于90%的参试品种约占5%。对于参加第1年和第2年的区域试验品种，其纯度检测可以与田间试验同步进行。然而，一旦进入生产试验阶段，这些品种的种子就已初步锁定，品种审定后，会提交至中国农业科学院种质资源库作为标准样品永久保存。实物种子与其对应的指纹图谱是维权打假的基础，若种子样品的纯度无法得到保障，那么标准指纹的采集工作必将受到影响，进而对后期的维权打假工作产生较大的负面影响，因此权衡经济和准确性等因素，建议加大生产试验纯度检测。
3.5 做好品种端、保护端和市场端的衔接
目前新品系在参加区域试验时，同步做DUS测试可使审定和保护基本同步，但标准样品并未同步。审定品种的标准样品来源于区域试验样品留样，品种权保护的标准样品来源于DUS测试样品，存在部分品种既审定又获得保护权后标准样品指纹不一致的问题，在市场上维权打假时易出现纠纷。尽管近年来国家已出台规定，要求统一管理审定保护标准样品库，并明确库中存在同名品种标准样品时不再接纳待送样品，但审定保护样品的一致性问题仍未得到根本解决。建议对标准样品库中的同名品种进行核实和清理，审定和保护品种标准样品均采用区试中的同一份留样，确保“一品种、一名称、一标样、一指纹”。
3.6 统一国内国际检测标准
在标准制定方面，目前ISTA发布的国际标准中列入了小麦品种DNA分子检测方法[42]，该方法规定利用14对SSR引物（其中8对引物为必用引物）进行小麦品种鉴定，主要解决品种真实性身份验证问题；UPOV正在探索解决小麦品种特异性鉴定、无相应的分子鉴定标准的难题；在指纹库构建方面，德国建立了502份欧洲小麦品种SSR指纹[43]。经研发单位测试，国际标准中的14对SSR引物无法完全区分我国的育成品种，不适合我国小麦品种鉴定。建议加强国际合作，共同研制通用的国际分子标记技术标准，克服当前不同国家因采取不同的分子标记技术标准，导致同一品种的指纹数据无法比对的困难。目前，国内同一作物存在同一类型不同标准的情况，建议同种作物同一个标准，由DNA指纹技术研发优势单位和作物育种优势单位等联合进行研发，开展多平台、多实验室内外部验证，并利用统一的标准构建统一共享的资源和品种指纹数据库，用于品种选育和管理。
参考文献
中国玉米审定品种标准SSR指纹库的构建
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.01.001
【目的】对数量庞大的已知玉米品种构建可共享的作物品种标准DNA指纹库。【方法】基于荧光毛细管电泳检测平台和植物品种DNA指纹库管理系统，利用筛选的40对SSR核心引物对3 998份中国玉米审定品种标准样品进行建库，通过多实验室、多检测平台进行建库数据的质量评估。【结果】绘制了40个玉米建库引物的等位基因频率分布图作为每个引物的特征图谱，在建库试验中发挥了相当于参照样品的作用。形成了一套十重荧光毛细管电泳组合，并在SSR指纹分析器中建立了一套系统默认PANEL作为不同实验室建库时的标准PANEL。统计玉米审定品种指纹库构建的试验情况，每份样品具有2—5套原始试验数据及对应的指纹图谱，其中61%的样品做了2组独立试验，33%的样品做了3组独立试验，最终建成的标准指纹库累计缺失和差异位点仅占0.2%，数据完整性达到99.8%。在不同实验室、不同电泳检测平台的评估结果表明，同一荧光电泳检测平台上获得SSR指纹数据一致性高，而不同的电泳检测平台获得的数据存在一定偏差，为实现不同实验室的SSR指纹数据共享，需要统一荧光引物、分析软件及电泳检测平台。对所有审定品种指纹数据进行整体两两比较，表明中国玉米审定品种之间差异比较大，品种间差异位点百分比集中在80%—95%（占78.28%），品种间差异位点百分比在50%以上的已达到99.21%，而低于20%的只有0.09%；对玉米审定品种杂合率水平进行分析，平均品种杂合率达到64%，主要集中在50%—80%（占89%）。通过玉米品种标准指纹比对服务平台（网址：http://www.maizedna.org/）实现了指纹库的共享。【结论】形成了构建作物品种SSR指纹库的标准化程序，构建了3 998份玉米审定品种的SSR指纹库，通过多实验室联合比较试验，保证建库数据的准确性和数据库的可共享性；建立了玉米品种标准指纹比对服务平台网站，实现玉米审定品种指纹库在全国种子检验系统的共享。
New resources for genetic studies in maize (Zea mays L.): a genome-wide Maize6H-60K single nucleotide polymorphism array and its application
Maize 6H-60K芯片在玉米实质性派生品种鉴定中的应用分析
DOI:10.3724/SP.J.1006.2023.23066
玉米实质性派生品种鉴定已成为当前种业知识产权保护的热点之一。为加快其精准高效分子鉴定技术的建立, 本文利用多种类型派生品种为研究材料: 京2416与京2416C (两者为遗传背景高度相近的两个自交系), 京724与京72464 (两者为遗传背景相近的两个自交系), 以及由京724与京72464两者构建的893个DH系遗传群体等。研究分析了Maize 6H-60K芯片(包含61,214个SNP位点集合)应用于玉米派生品种鉴定的潜力。结果显示: (1) 京2416与京2416C间存在829个SNP位点差异, GS值(遗传相似度)为98.7%, 56.7%的差异位点集中分布在5号染色体长度约39 Mb区域内。(2) 京724与京72464之间差异位点数目为4912个, GS值为90.1%, 44.8%的差异位点集中分布在3号染色体上。(3) 893个DH系与2个亲本京724及京72464之间的GS值分布均呈现连续性, 其中与京724之间的GS值范围88.0%~97.0%, 平均值为92.6%; 与京72464之间的GS值范围88.3%~98.6%, 平均值为94.5%。(4) 893个DH系进行两两成对比较, 共比较398,278对, 所有DH系之间均有明确的SNP位点差异; GS值最小为87.5%, 最大为99.9%, 平均值为94.3%。结果表明Maize 6H-60K包含的SNP位点集能够精准评估派生、近似或极近似自交系及DH系的遗传背景, 将所有材料一一鉴别明确区分开来, 并具有进一步锁定与派生性状连锁标记的潜力。建议亟需基于Maize 6H-60K SNP位点集合, 利用高效芯片、靶向测序等平台建立玉米实质性派生品种分子鉴定技术规程, 为玉米品种知识产权保护、品种创新等提供技术支撑。
用于玉米品种真实性鉴定的最优核心SNP位点集的研发
DOI:10.3724/SP.J.1006.2024.33052
[本文引用: 1]
品种真实性是种子质量监测的一个重要指标。为建立准确可靠、快速简便、高通量、低成本的玉米品种真实性鉴定技术, 本文利用200个核心SNP位点构建的5816个玉米杂交品种, 3274个自交系的指纹数据, 基于遗传算法、品种识别率评估确定了一套高鉴别力的核心SNP位点集, 包含96个SNP位点。这96个SNPs全部位于基因内区域, 相对均匀分布在10对染色体上。采用上述杂交品种和自交系的指纹数据评估显示这96个位点具有较高多态性和品种区分能力, PIC、MAF、DP平均值分别为0.36、0.40、0.60和0.36、0.39、0.48, 对杂交品种、自交系的品种识别率达到99.14%和99.24%。两两样品成对比较结果显示, 99.99%的品种间差异位点数目≥3个, 杂交品种和自交系中96.74%和95.67%的成对比较差异位点数目集中在30~65个和30~60个。基于221个主推杂交品种的40个SSR位点、96个SNP位点的基因型数据分析结果显示, 这2组标记集的鉴定结果具有较高的一致性。综上所述, 本研究报道了一套具有位点数量最少、区分能力最强, 兼容多平台、适于自动化分型等优点的最优核心SNP集。期望位点集将在玉米品种真实性监测、种子质量控制中得到广泛应用, 进而维护玉米种子市场秩序、保障育种者权利以及保护农民利益。
南方稻区国家水稻区域试验品种的微卫星标记分析
利用前期研究筛选的12个微卫星标记（SSR）首选标记对2005年南方稻区国家水稻区域试验199个水稻品种进行了DNA指纹鉴定，构建了199个水稻品种×12个首选标记的南方稻区国家水稻区域试验品种DNA指纹库。在首选标记座位上，常规稻和杂交稻的主导等位基因基本相同，籼稻和粳稻的主导等位基因差异较大；常规稻品种的纯合度高，多数杂交稻品种的杂合度较高、杂合座位数呈正态分布。比较相同母本的系列杂交稻组合，表明主导不育系系列组合具有较高的组内品种间母本一致性。此外，对南方稻区国家水稻区域试验品种特异性鉴定、DNA指纹库的扩充和鉴定标记数的确定进行了讨论。关键词
利用SNP标记进行水稻品种籼粳鉴定
DOI:10.3724/SP.J.1006.2022.02085
[本文引用: 1]
亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)分为籼、粳2个亚种, 随着杂交水稻的发展、种间杂种优势的利用, 籼粳之间的界限变得越来越模糊。本研究利用3000份水稻种质资源信息, 通过计算约2000万个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点的SNP-index值, 进行籼粳特异SNP位点筛选, 最终得到4084个籼粳特异SNP位点(4k-SNP); 同时确定以籼粳指数作为水稻品种籼粳鉴定的指标。研究进一步采用大规模简单随机取样等统计分析方法对籼粳特异位点进行数据降维处理, 将4k-SNP精简至40个SNP位点(40-SNP), 用于水稻籼粳鉴定。为了验证40-SNP的籼粳鉴定效果, 本研究一方面利用水稻生产上推广的82份选育品种, 对40-SNP籼粳鉴定结果与4k-SNP鉴定结果进行比较, 结果发现40-SNP与4k-SNP得出的粳型指数非常接近, 相关系数为0.99; 另一方面利用全球6类型(indica、aus、rayada、aromatic、tropical japonica、temperate japonica)水稻品种共49份材料, 对40-SNP籼粳鉴定结果与4k-SNP及程氏指数法籼粳鉴定结果进行比较, 发现40-SNP与4k-SNP及程氏指数法籼粳鉴定结果的相关系数分别在0.98和0.86以上。这些结果证实了40-SNP对水稻品种籼粳鉴定的有效性及准确性。另外发现40-SNP对水稻6种亚群类型也有很好鉴别效果, 其中indica的粳型指数 < 0.20, aus的粳型指数在0.20~0.40, rayada和aromatic的粳型指数在0.60~0.85之间, tropical japonica的粳型指数 > 0.90, temperate japonica粳型指数最高, 基本为1.00。本研究为研究水稻籼粳分化、杂种优势利用以及水稻种子管理条例制定等方面提供了数据支撑及理论基础。
小麦F型雄性不育系和恢复系SSR指纹图谱构建及遗传差异分析
Consensus linkage map construction and QTL mapping for eight yield-related traits in wheat using the BAAFS Wheat 90K SNP array
DOI:10.1016/j.jia.2023.07.028 URL [本文引用: 2]
棉花DUS测试标准品种的SSR指纹数据库构建
DOI:Y2015/V27/I1/46
基于SSR核心引物，采用荧光毛细管电泳检测系统与多重PCR技术相结合，构建我国棉花DUS(Distinctness, Uniformity and Stability)测试标准品种的DNA指纹数据库并进行遗传多样性分析。依据多重PCR组合的基本原则与五色荧光检测系统的特点，采用40对核心引物构建了10个4重PCR组合，利用DNA遗传分析仪进行指纹检测与数据采集。40对荧光引物在30份DUS测试标准品种中共扩增产生146个等位变异，每对引物的等位变异数为2～7个不等，平均每对引物产生3.65个等位变异。海7124与陆地棉品种明显划分为2类，来源于新疆的新陆早1号区别于其他陆地棉品种，单独聚为1类。多色荧光检测系统相比常规聚丙烯酰胺凝胶电泳具有高精度、高通量、自动化程度高的优点，尤其适用于大规模指纹数据库的构建，提出了通过构建已知品种DNA指纹数据库，将分子标记技术应用于棉花DUS测试的初步设想。
利用CottonSNP63K芯片构建棉花品种的指纹图谱
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.24.003
[本文引用: 1]
【目的】利用SNP位点的单拷贝特性，结合陆地棉TM-1参考基因组序列信息，筛选基因组特异的SNP。【方法】以719份遗传背景来源广泛的陆地棉种质资源为材料，采用Illumina公司开发的CottonSNP63K芯片，利用GenomeStudio软件对芯片扫描所获得原始数据进行基因型数据质量控制，获得待测样品SNP位点的基因型数据。根据已公布的陆地棉TM-1基因组的两个版本——中国农业科学院棉花研究所版本Gossypium hirsutum（AD1）genome BGI v1.0与南京农业大学版本G. hirsutum（AD1）genome NBI v1.1为参考序列，对CottonSNP63K芯片（63 058个SNP）各位点的侧翼序列分别进行全基因组Blast比对分析，以筛选具有单拷贝特性的特异SNP位点并用于样品指纹图谱的构建。【结果】利用CottonSNP63K芯片对719份材料进行SNP位点基因分型，主要表现为无检出信号的SNP位点、无多态性的SNP位点、具有多态性的SNP位点，而具有多态性的SNP位点的分型结果又可分为单位点SNP（基因组特异SNP）、双位点SNP和多位点SNP。通过对两个已公布的陆地棉TM-1参考基因组序列Blast比对结果表明，中国农业科学院棉花研究所TM-1基因组版本比对获得基因组特异SNP标记为5 474个，而南京农业大学TM-1基因组版本比对获得基因组特异SNP标记仅为1 850个，两者共有的特异SNP为1 594个，进一步通过分型效果、检出率及多态性3个评价指标，筛选score值≥0.7，call frequency值≥0.95，且MAF值≥0.2的SNP位点，获得471个分型效果理想，检出率高且多态性较高的特异SNP位点。在471个SNP位点中，430个位于染色体上，41个位于scaffold片段上。考虑到标记间的连锁程度，剔除连锁标记37个，最终获得393个核心SNP位点。利用393个核心SNP构建了719份品种资源的特征DNA指纹图谱，除个别材料之间遗传背景高度相似、基因型完全一致外，97%的材料均能实现准确有效的鉴别。【结论】筛选出393个基因组特异的SNP，并利用这些核心SNP构建了719份资源材料的特征DNA指纹图谱，为SNP分子标记应用于棉花重要性状遗传改良提供了参考。
国家大豆区域试验品种(系)SSR位点纯合度分析
DOI:10.3724/SP.J.1006.2012.01760
[本文引用: 1]
利用30对SSR引物，检测2005—2009年参加国家区域试验的1 068份大豆品种(系)的位点纯合度。每年区试品种(系)的平均纯合度为94.9%~97.6%，纯合度高于85%和90%的品种(系)所占比例分别为95%和91.4%，纯合度低于85%的品种(系)有42份(占3.93%)，主要为北方春大豆和黄淮夏大豆。位点纯合度低于85%的参试品种(系)的产量比较表明，只有11份品种(系)比对照增产5%以上，20份比对照减产0.04%~13.08%；与纯合度为100%的材料比较发现，位点纯合度较低的材料在区试中产量也较低。建议国家区试品种(系)纯合度标准不低于90%，以保证审定品种的特征特性，为大豆新品种的持续推广利用提供科技支撑。
利用SNP芯片构建我国冬油菜参试品种DNA指纹图谱
DOI:10.3724/SP.J.1006.2018.00956
[本文引用: 1]
以2016?2017年度187份国家油菜参试品种及2015?2016年度33份续试品种为材料, 利用油菜60K Illumina Infinium SNP (single nucleotide polymorphism)芯片进行基因分型, 得到52 157个SNP标记。按照分型为AA和BB频率不为0、最小基因型频率(minor freq)大于0.05、SNP得率(call freq)大于0.80、样品缺失率小于5%及分型明晰的要求筛选出5374个SNP标记。这些标记的PIC (polymorphism information content)均值为0.27, PIC值大于0.25的SNP标记占55.94%。其中有5143个SNP标记能对应到A1~A10、C1~C9连锁群上, 且比较全面地覆盖了油菜的基因组。用PowerMarker、MEGA等软件对224份样品的5374个标记分析, 结果显示: (1)设置8个品种重复2次点样对照, 得出Infinium芯片的技术误差为0.36%, 与Illumina公司公布的0.1%的技术误差十分接近。(2) NJ (Neighbor-joining)聚类分析中, 97.86%的区试品种的相似系数小于95%、87.88%的续试品种相似系数大于95%, 相似系数95%可作为品种特异性及一致性鉴定的阈值。这5374个SNP标记在油菜全基因组上分布均匀、多态性高、区分度好, 可用于甘蓝型油菜品种特异性和一致性的鉴定分析及甘蓝型油菜品种DNA指纹图谱构建的研究。
建立小麦品种DNA指纹的方法研究
建立小麦DNA指纹对遗传资源评价、品种权益保护、种子质量鉴定具有重要的意义。本研究采用15个SSR标记和20个AFLP-SCAR标记，分析了来自我国不同麦区的455个小麦品种，证明用两种分子标记建立小麦DNA指纹可以更加全面地反应品种的遗传多样性。从而，在提出采用SSR标记与AFLP-SCAR标记构建小麦品种DNA指纹的技术路线的基础上，建立了构建DNA指纹的方法模式。按此方法获得的品种指纹代码可以经条形码软件转换为条形码，使为每个品种建立身份证的设想成为可能。
Assessment of wheat variety stability using SSR markers
DOI:10.1007/s10681-013-1006-z URL [本文引用: 1]
Detecting seed purity of wheat varieties using microsatellite markers based on eliminating the influence of non-homozygous loci
DOI:10.15258/sst URL
Assessment of wheat variety distinctness using SSR markers
DOI:10.1016/S2095-3119(15)61057-7 URL
Assessment of wheat variety uniformity using SSR markers
国家农作物品种审定委员会关于印发《国家级小麦品种审定标准(2024年修订)》的通知
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Construction and analysis of a microsatellite-based database of European wheat varieties
