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作物杂志, 2019, 35(4): 84-93 doi: 10.16035/j.issn.1001-7283.2019.04.013

遗传育种·种质资源·生物技术

水稻功能性插入缺失标记（InDel）的筛选与应用

王钰, 马卉, 许学, 秦瑞英, 杨剑波, 汪秀峰

安徽省农业科学院水稻研究所,230031,安徽合肥

Screening and Application of Functional Insertion-Deletion Markers (InDel) in Rice

Wang Yu, Ma Hui, Xu Xue, Qin Ruiying, Yang Jianbo, Wang Xiufeng

Rice Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230031, Anhui, China

通讯作者: 汪秀峰，研究员，主要从事转基因分子检测方面的研究

收稿日期: 2019-03-13   修回日期: 2019-04-18   网络出版日期: 2019-08-15

基金资助: 国家科技支撑计划(2015BAD02B02)
青年科学基金(31601289)
院长青年创新基金(17B0102)

Received: 2019-03-13   Revised: 2019-04-18   Online: 2019-08-15

作者简介 About authors

王钰,硕士,研究方向为种子分子检测;马卉为共同第一作者,副研究员,研究方向为农作物分子检测 。

摘要

开展水稻品种纯度和真实性鉴定对水稻遗传育种和种子生产有着重要的意义。以245个长江中下游主推水稻品种为研究材料,从643个插入缺失（InDel）位点中筛选出124个功能性多态性位点,建立了InDel高效检测体系。进一步利用InDel标记vf0121641804和SSR标记RM7120分析水稻样品的纯度,同时选用覆盖12条染色体的24对InDel引物和48对SSR标准引物分析水稻品种真实性,结果表明,采用InDel标记检测水稻品种纯度和真实性的结果与采用SSR标记检测结果一致,说明水稻功能性InDel标记也可用于水稻品种纯度和品种真实性的鉴定。在此基础上,鉴定了245个水稻品种124个InDel标记的基因型遗传多样性并进行了聚类分析,结果表明,水稻材料间存在明显的群体结构,基本反映了不同品种间的亲缘关系。水稻功能性InDel标记的筛选与应用,不仅为品种纯度和真实性鉴定、遗传多样性分析提供了新方法;而且可用于分子辅助育种,提高强优势组合的预见性。

关键词： 水稻 ; InDel ; 多态性位点 ; 品种纯度 ; 品种真实性 ; 遗传多样性

Abstract

The identification of the purity and authenticity of rice varieties has important significance for rice improvement and breeding. In this study, we identified 124 highly polymorphic funcitional insertion-deletion (InDel) loci from 643 InDel loci in rice genome using 245 rice varieties which were main pushed in the Yangtze River. We also developed an efficient detection system of InDel genotypes. We detected the purity of rice variety using InDel marker vf0121641804 and SSR marker RM7120 and analyzed the authenticity of rice varieties using 24 InDel markers and 48 standard SSR marker disturbing rice 12 chromosomes. Results showed that rice purity and authenticity detected using InDel marker were similar to those using SSR markers. At the same time, we analyzed the genotypes of 245 rice varieties using 124 InDel markers. The results showed that there was a distinct group structure between all surveyed samples, reflecting to the kinship between different varieties. The development of functional InDel markers provides new methods for the identification of the purity and authenticity of rice varieties and for the analysis of genetic diversity, which is also helpful to the prediction of hybrid rice with strong heterosis in molecular breeding in the future.

Keywords： Rice ; InDel ; Polymorphism site ; Purity of variety ; Authenticity of variety ; Genetic diversity

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本文引用格式

王钰, 马卉, 许学, 秦瑞英, 杨剑波, 汪秀峰. 水稻功能性插入缺失标记（InDel）的筛选与应用[J]. 作物杂志, 2019, 35(4): 84-93 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2019.04.013

Wang Yu, Ma Hui, Xu Xue, Qin Ruiying, Yang Jianbo, Wang Xiufeng. Screening and Application of Functional Insertion-Deletion Markers (InDel) in Rice[J]. Crops, 2019, 35(4): 84-93 doi:10.16035/j.issn.1001-7283.2019.04.013

水稻是我国重要的粮食作物,杂交水稻更是以其显著的产量优势为我国乃至世界粮食安全做出了巨大贡献。新品种的推广和使用对保障我国粮食供应、满足人们多元化需求发挥了极其重要的作用。2001-2015年,全国各地通过省级以上审定的水稻品种就达6 310个（http://www.ricedata.cn/variety/index.htm）。有效鉴定这些品种材料,对水稻品种选育、试验、质量和市场管理以及产权保护具有重要的现实意义[1,2]。

基因的差异导致品种形态差异和特征特性的不同。目前区别水稻品种较为有效、快捷的方法是利用DNA分子标记鉴别不同品种基因型的差异[3,4]。Moore等在1991年创立了SSR标记技术,在水稻基因组中,平均每157kb才有一个SSR位点[5],因此SSR分子标记密度还远远达不到要求。另外,它与水稻品种农艺性状关联性较差,难以区分近等基因系或功能代换系[6]。InDel（Insertion-Deletion）标记即插入缺失标记[7,8,9],指的是两种基因型在全基因组中的差异,相对于其中一个基因型而言,另一个基因型的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失位点,设计一些特异扩增识别这些插入缺失位点的PCR引物,这就是InDel标记,是一类共显性标记[10,11]。InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目多。就分布密度而言,平均每953bp就有一个InDel位点,仅次于每268bp就有一个SNP位点,但远高于SSR标记位点[12,13]。SNP标记在理论上潜力很大,但由于目前检测方法和成本的限制,并没有进行广泛的应用[14,15]。InDel标记准确性高、变异稳定,避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊[16,17]。本研究从InDel标记的特点出发,下载并设计大量有关InDel标记引物,对水稻材料进行分析,根据其在种内和种间都有多态性、通用性较强的特点来筛选功能性InDel位点,为实现InDel标记在生物的遗传多样性分析、品种鉴定、亲子分析等方面的广泛应用打下基础。

1 材料与方法

试验于2015年7月-2018年9月进行,室内试验于安徽省农业科学院水稻研究所生物技术实验室完成,田间种植在合肥岗集试验基地完成。

1.1 试验材料

收集长江中下游地区主推水稻品种245个（表1）,其中,常规种/亲本157个,两系杂交种38个,三系杂交种50个。对部分纯度存在疑问的品种进行田间种植去杂,统一编号后备用。

表1   供试水稻品种的名称、类型及类群

Table 1  Name, type and group of rice varieties for testing

编号
Number		品种
Variety		类型
Type		类群
Group		编号
Number		品种
Variety		类型
Type		类群
Group		编号
Number		品种
Variety		类型
Type		类群
Group
1绍糯9714常规种/亲本ⅡA50恢52常规种/亲本ⅠA99沪恢6号常规种/亲本ⅠA
2高科1号常规种/亲本ⅠA51密阳46常规种/亲本ⅠB100cp120常规种/亲本ⅠA
3泸香658常规种/亲本ⅠA529311常规种/亲本ⅠA101恢527常规种/亲本ⅠA
4德香4103常规种/亲本ⅠA53RH003常规种/亲本ⅠA102898常规种/亲本ⅠA
5浙农34常规种/亲本ⅠA54ZH128常规种/亲本ⅠA103盐559常规种/亲本ⅠA
6中嘉早17常规种/亲本ⅠA55红98常规种/亲本ⅠA104零57常规种/亲本ⅠA
7嘉兴8号常规种/亲本ⅠA56R6547常规种/亲本ⅠA105明63常规种/亲本ⅠA
8镇稻15常规种/亲本ⅠA57R118常规种/亲本ⅠA106IR50迟穗常规种/亲本ⅠA
9淮稻12常规种/亲本ⅠA58安香2号常规种/亲本ⅠA107杨6无芒常规种/亲本ⅠA
10皖稻68常规种/亲本ⅠA59川香6号常规种/亲本ⅠA108特青常规种/亲本ⅡA
11黄糯2号常规种/亲本ⅠA60明恢100常规种/亲本ⅠA109成恢448常规种/亲本ⅠA
12皖垦糯1号常规种/亲本ⅠA61明恢77常规种/亲本ⅠA110镇江084常规种/亲本ⅠA
13中优838常规种/亲本ⅠA62黥香恢788常规种/亲本ⅠA111培矮64常规种/亲本ⅠA
14皖稻197常规种/亲本ⅠA63测64常规种/亲本ⅠA112Li7954常规种/亲本ⅠA
15嘉育253常规种/亲本ⅠA64创丰占常规种/亲本ⅠA113万恢88常规种/亲本ⅠA
16新强8号常规种/亲本ⅠA65奉化占常规种/亲本ⅠA114R602常规种/亲本ⅠA
17五山丝苗常规种/亲本ⅠA66丰美占常规种/亲本ⅠA115Liu3149常规种/亲本ⅠA
18粳糯4921常规种/亲本ⅠA67广香籼常规种/亲本ⅠA116明恢1273常规种/亲本ⅠA
19竹舟5号常规种/亲本ⅠA68黄华占常规种/亲本ⅠA117m125常规种/亲本ⅠA
20早籼65常规种/亲本ⅠA69皖籼316常规种/亲本ⅠA118R-725常规种/亲本ⅠA
21绿稻24常规种/亲本ⅡA70早籼14常规种/亲本ⅠA119南京16常规种/亲本ⅠA
22金奉19常规种/亲本ⅡA71皖稻89常规种/亲本ⅠA120中香1号常规种/亲本ⅠA
23皖稻113常规种/亲本ⅠA72中籼898常规种/亲本ⅠA121粤航1号常规种/亲本ⅠA
24安选6号常规种/亲本ⅠA73中籼352常规种/亲本ⅠA122R1846常规种/亲本ⅠA
25早籼15常规种/亲本ⅠA74盐稻8号常规种/亲本ⅠA123N456常规种/亲本ⅠA
26皖稻141常规种/亲本ⅠA75泰国籼常规种/亲本ⅡA124R-11常规种/亲本ⅠA
27丰优58常规种/亲本ⅠA76中香6号常规种/亲本ⅠA125海南常规稻常规种/亲本ⅠA
28皖稻173常规种/亲本ⅠA773263常规种/亲本ⅠA126肖37878常规种/亲本ⅠA
29W262常规种/亲本ⅠA78镇籼96常规种/亲本ⅠA127KL90（童）常规种/亲本ⅠA
30皖稻84常规种/亲本ⅠA79C4115常规种/亲本ⅠA128Liu矮常规种/亲本ⅠA
31绿旱1号常规种/亲本ⅠA80NIJR05常规种/亲本ⅡA129创优2号常规种/亲本ⅠA
32滁9507常规种/亲本ⅠA81武运粳14常规种/亲本ⅡA130IR24（尹）常规种/亲本ⅠA
33川农1号常规种/亲本ⅠA82凡7常规种/亲本ⅡA131CO39（尹）常规种/亲本ⅠA
34协优009常规种/亲本ⅠA83R18常规种/亲本ⅡA132明86（夏）常规种/亲本ⅠA
35R96-2常规种/亲本ⅠA84C418常规种/亲本ⅠA133丰华占常规种/亲本ⅠA
36丰优188常规种/亲本ⅠA85HP121常规种/亲本ⅠA134明恢86常规种/亲本ⅠA
37中早33常规种/亲本ⅠA86皖恢9号常规种/亲本ⅠA135五色黑米常规种/亲本ⅠA
38安育早1号常规种/亲本ⅠA877NP285常规种/亲本ⅡA136五色红米常规种/亲本ⅠA
39早籼2430常规种/亲本ⅡA88XH022常规种/亲本ⅡA137红香米常规种/亲本ⅠA
40中籼2503常规种/亲本ⅠA89M1148常规种/亲本ⅡA138红米常规种/亲本ⅠA
41天香58常规种/亲本ⅠA90粤B常规种/亲本ⅡA139红米早籼常规种/亲本ⅠA
42天协13常规种/亲本ⅠA91R18选常规种/亲本ⅡA140镇籼122常规种/亲本ⅠA
43晚粳22常规种/亲本ⅠA9252常规种/亲本ⅠB1414M92常规种/亲本ⅠA
44宁粳3号常规种/亲本ⅠA932428常规种/亲本ⅠA1428019常规种/亲本ⅠA
45早籼788常规种/亲本ⅠA94贵9B常规种/亲本ⅠA143四丰43常规种/亲本ⅠA
46川农2号常规种/亲本ⅠA95SR54常规种/亲本ⅡA144青元矮常规种/亲本ⅠA
47糯稻N-2常规种/亲本ⅠA96中9B常规种/亲本ⅠA145春江06常规种/亲本ⅠA
48早籼18常规种/亲本ⅠA97NLjR09常规种/亲本ⅠA1468077s常规种/亲本ⅠA
49838常规种/亲本ⅠA98II-32B常规种/亲本ⅠA147HL514常规种/亲本ⅡA
编号
Number		品种
Variety		类型
Type		类群
Group		编号
Number		品种
Variety		类型
Type		类群
Group		编号
Number		品种
Variety		类型
Type		类群
Group
148IR26常规种/亲本ⅠA181扬两优6号两系杂交稻ⅠA214天优华占三系杂交稻ⅠA
149南粳15常规种/亲本ⅠA182丰两优1号两系杂交稻ⅠA215K优52三系杂交稻ⅠA
150紫稻常规种/亲本ⅠA183广两优76两系杂交稻ⅠA216丰优126三系杂交稻ⅠA
151ZH199常规种/亲本ⅠA184徽两优996两系杂交稻ⅠA217丰源优272三系杂交稻ⅠA
152GP15常规种/亲本ⅠA185新两优香4两系杂交稻ⅠA218荃香优512三系杂交稻ⅠA
153IR8常规种/亲本ⅠA186淮两优3号两系杂交稻ⅠA219广籼优4号三系杂交稻ⅠA
154黑米常规种/亲本ⅠA187两优036两系杂交稻ⅡB220科优16三系杂交稻ⅠA
155IR64常规种/亲本ⅡA188两优100两系杂交稻ⅠA221农华优808三系杂交稻ⅠA
156B5常规种/亲本ⅠA189两优华6两系杂交稻ⅠA222冈优1577三系杂交稻ⅠA
157五常香常规种/亲本ⅠA190广两优100两系杂交稻ⅠA223新优188三系杂交稻ⅠA
158两优631两系杂交稻ⅠA191丰两优3号两系杂交稻ⅡA224金优88三系杂交稻ⅠA
159广两优香66两系杂交稻ⅠA192新两优98两系杂交稻ⅠB225中优1671三系杂交稻ⅠA
160Y两优1号两系杂交稻ⅠA193安两优821两系杂交稻ⅠA226协优63三系杂交稻ⅠA
161Y两优9918两系杂交稻ⅠA194常两优2号两系杂交稻ⅠB22780优121三系杂交稻ⅠA
162深两优865两系杂交稻ⅠA195丰两优80两系杂交稻ⅠA228Ⅲ优98三系杂交稻ⅠA
163新华两优9号两系杂交稻ⅠA196中浙优8号三系杂交稻ⅠA229协优9019三系杂交稻ⅠA
164华两优1206两系杂交稻ⅠA197甬优10号三系杂交稻ⅡA230协优58三系杂交稻ⅠA
165C两优608两系杂交稻ⅠA198春优84三系杂交稻ⅡA231丰优293三系杂交稻ⅡA
166两优363两系杂交稻ⅠA199浙优18三系杂交稻ⅡA232Ⅱ优107三系杂交稻ⅠA
167丰两优晚三两系杂交稻ⅠA200钱优0508三系杂交稻ⅠA233庐优855三系杂交稻ⅠA
168广两优1128两系杂交稻ⅠA201扬籼优418三系杂交稻ⅠA234怀优4号三系杂交稻ⅠB
169II优98两系杂交稻ⅠA202甬优538三系杂交稻ⅡA235新隆优1三系杂交稻ⅠA
170科两优889两系杂交稻ⅠA203科优8377三系杂交稻ⅠA236丰晚籼优1号三系杂交稻ⅠA
171徽两优5号两系杂交稻ⅠA204川香优2号三系杂交稻ⅠA237辐优138三系杂交稻ⅠA
172隆两优6号两系杂交稻ⅠA205甬优1540三系杂交稻ⅡA238天优81三系杂交稻ⅠA
173丰两优9号两系杂交稻ⅠA206T优15三系杂交稻ⅠA239开优8号三系杂交稻ⅠA
174II优1256两系杂交稻ⅠA207丰优9号三系杂交稻ⅠA240中2优1286三系杂交稻ⅠB
175深两优862两系杂交稻ⅠA208浙糯优1号三系杂交稻ⅡA241新隆粳3号三系杂交稻ⅠA
176两优6326两系杂交稻ⅠA209宜优673三系杂交稻ⅠA242Ⅱ优8号三系杂交稻ⅠA
177C两优华占两系杂交稻ⅠA210天优998三系杂交稻ⅠA243辐优155三系杂交稻ⅠA
178丰两优香1号两系杂交稻ⅠA211五优308三系杂交稻ⅠA244丰优512三系杂交稻ⅡA
179徽两优6号两系杂交稻ⅠA212嘉禾优555三系杂交稻ⅡA245辐优136三系杂交稻ⅠA
180两优688两系杂交稻ⅠA213欣荣优华占三系杂交稻ⅠA

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1.2 水稻功能性InDel标记位点的筛选

从决定水稻品种特征的性状和特点出发,选择与水稻主要农艺性状密切相关的已知重要功能基因。通过中国水稻数据中心网站（http://www.ricedata.cn/gene/index.htm）,结合相关文献,下载整理与水稻主要农艺性状紧密连锁的功能基因（261个）的座位（Locus）号、基因符号、相关性状、基因功能等相关数据。

1.3 InDel位点引物设计

在InDel位点的上、下游各100bp范围内,利用Primer 5软件设计PCR扩增引物,引物对的参数要求:长度最适20bp、最大25bp、最小18bp,退火温度最适59℃、最大62℃、最小57℃,GC含量最适50%、最大80%、最小20%,最大自我互补45%,最大3′自我互补35%,最大引物对互补45%,最大3′引物对互补35%。

1.4 纯度和真实性的试验方法

纯度和真实性的具体试验方法参考国家标准《三系杂交水稻及亲本真实性和品种纯度鉴定DNA分析方法（GB/T20396-2006）》[18]和出入境行业标准《两系水稻品种真实性和纯度鉴定DNA分析法》[19]。DNA的提取采用CTAB法[20,21],在田间种植的品种,选取抽穗期典型单株幼嫩叶片,其余品种进行室内发苗（单株提取,每品种12个单株）,用超微量核酸蛋白检测仪测定DNA浓度,用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）检测DNA质量,-20℃保存。PCR扩增体系为1×PCR缓冲液,2.5mmol/L Mg2+,0.25mmol/L dNTPs,0.2μmol/L上游引物、0.2μmol/L下游引物,1.0U Taq DNA聚合酶,20~40ng DNA模板,总体积10μL。反应程序为94℃ 5min,94℃ 45s,55℃ 45s,72℃ 1min,循环30次,72℃ 5min,4℃保存。

1.5 数据处理

根据PAGE电泳图来整理数据,每对InDel引物检测1个位点,所得的每一条多态性条带为1个等位变异,根据每个InDel标记检测出的等位变异的有无进行标记,有记为“1”,无记为“0”。用NTSYS 2.1软件计算群体间的遗传相似系数[22,23],根据所得到的相似系数,用非加权配对算术平均法进行聚类分析,并绘制树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 水稻功能性InDel标记位点的筛选

通过网站http://ricevarmap.ncpgr.cn/下载整理上述功能基因内的InDel位点4 670个。然后在国家水稻数据中心网站（http://www.ricedata.cn/gene/）上进行筛选,剔除位置或效应为内含子（INTRON）的非功能性位点,保留位置或效应为上游（UPSTREAM）、下游（DOWNSTREAM）,非编码区5'端（UTR_5_PRIME）,非编码区3'端（UTR_3_PRIME）,密码子插入（CODON-INSERTION）,密码子缺失（CODON-DELETION）,新剪切位点（SPLICE-SITE-ACCEPTOR）,移框（FRAME SHIFT）等,且插入缺失大于3bp的位点,最终获得功能性InDel位点643个,合成相应的InDel引物643对。从征集的水稻品种中随机选取96个品种的DNA为模板,对643对InDel引物进行PCR扩增,利用PAGE银染显色,根据扩增条带的有无、可读性、清晰度和多态性,剔除多态性低或无多态性的位点,保留多态性高的位点,最终筛选出扩增稳定、多态性高的InDel标记位点124个（表2）。

表2   InDel标记位点及对应的引物序列

Table 2  InDel markers and corresponding primer sequences

序号
Number		基因座位
Gene locus		InDel位点
InDel point		性状
Character		基因
Gene		上游引物
Upstream primer (5′-3′)		下游引物
Downstream primer (5′-3′)
1LOC_Os01g02890vf0101045823穗型sui1TCTGCCATTGACGGTTACCTTCAGTCAAAACCACCAGGGA
2LOC_Os01g02890vf0101045824穗型sui1TCTGCCATTGACGGTTACCTTCAGTCAAAACCACCAGGGA
3LOC_Os01g02890vf0101046394穗型sui1CCCCCAAAAAAATATTGCAAATGGCAAAGAAGGGTGGTCTGCTG
4LOC_Os01g02890vf0101046400穗型sui1CCCCCAAAAAAATATTGCAAATGGCAAAGAAGGGTGGTCTGCTG
5LOC_Os01g02890vf0101046696穗型sui1CGCAGGTCAAATCGTCGAATGTGGACAACATGAAATGGTCCA
6LOC_Os01g02890vf0101047729穗型sui1AAGGATTCCTTTTTGTTGATATGTCAAGAAGGTGCCTGAAGAAATGAATAA
7LOC_Os01g08700vf0104337406抽穗期OsGITTCAACCAATCCGGACCTCATTTCTCGCCTCTCCTTCCTC
8LOC_Os01g08700vf0104337480抽穗期OsGIGGAGGAGAGAGAGAGGGAGAGGAAATAGCGCGGCCACT
9LOC_Os01g10110vf0105274528每穗实粒数Gn1a; OsCKX2ATCCTGACCTGCTCTTGCTTATAGGCCACCTTGTCCCTTC
10LOC_Os01g38530vf0121638848抽穗期、千粒重OsEF3CGAGCTCGCTTAAATCCTTGGTCTTTCTAGCCTTGTTTCTGCA
11LOC_Os01g38530vf0121641804抽穗期、千粒重OsEF3CATCACCTTCCCCCTCTCCTCCTTCCTTTCCTCGACCTG
12LOC_Os01g38530vf0121641930抽穗期、千粒重OsEF3CAGGTCGAGGAAAGGAAGGACCTTCGCCTTCCATTCCATG
13LOC_Os01g39630vf0122357349雌性不育、雄性不育RAD51CACTTGGGAGGTTGAGGATGGCAACGTGCCTCATCACTCTG
14LOC_Os01g39680vf0122381968花粉败育Sa; SaM;SaFGGGATTGAAGATGCGTGCATTGGGGTAGACGGGGAGATAA
15LOC_Os01g39680vf0122381972花粉败育Sa; SaM;SaFGTCATGCTGTTGTTGCCGTATGGGGTAGACGGGGAGATAA
16LOC_Os01g40630vf0122956069株型LOGCGTACGTAATGCAGTGGTCAATCGCATTTGCCTTGCCTTC
17LOC_Os01g40630vf0122956073株型LOGCGTACGTAATGCAGTGGTCAATCGCATTTGCCTTGCCTTC
18LOC_Os01g40630vf0122956997株型LOGGGCCCCAGATGCATTCAAAAAGATTGGGGGTAGGAGGAGT
19LOC_Os01g40630vf0122957399株型LOGCCAAAAGGTGGGGGAGAGAATCATGATTGCTGGCGAGC
20LOC_Os01g47710vf0127287637穗型DWT1TGCAAGATATATTAGAACCCTAGCTGCTGTACTAGTTAAGTGGCCC
21LOC_Os01g62920vf0136444446落粒性qSH1TCAATCTCTCTATAGCCCGCAGCGACATGGCTTGATGATCA
22LOC_Os01g65900vf0138261366株高OsPH1TTTGGGAGTTGCAGGTTGTGAAGGTCCTGATCGTGTGGAG
23LOC_Os01g65900vf0138264444株高OsPH1ACGGAAATGGGAAGGAGAGGCCACTCGCTATCCCCAACC
24LOC_Os01g65900vf0138264465株高OsPH1ACGGAAATGGGAAGGAGAGGCCACTCGCTATCCCCAACC
25LOC_Os01g66100vf0138384219株高sd1; GA20ox-2GGAACGAACAGAAGCCGATTAGCGGTAGGGTCCAAAATTG
26LOC_Os01g70220vf0140362882抽穗期SDG714GGGAGTAGGAGCAGAGCAAATGCACTGCCAAACTTATGCA
27LOC_Os01g72090vf0141823973抽穗期Se13; OsHY2CGAAGCTGACGAACTTGTGGACACAACTACTACTTGCCACTG
28LOC_Os01g72090vf0141824002抽穗期Se13; OsHY2CGAAGCTGACGAACTTGTGGGCAGGGACAGATGTGGCTAA
29LOC_Os02g05840vf0202882064叶角度、抽穗期LC2; OsVIL3GTGGATCCATGGCGAATTGGGAAGAGGAGGGGAGAGTCCA
30LOC_Os02g07430vf0203833298子粒形状OsMADS29CCAGTTCAGTAGTTCACACACCTCAATTGTTCATCGTTCTGGACA
31LOC_Os02g10900vf0205785307叶色RLS1GGCGCCATCAGGTCTATACTTAGTTGCCTCTGTGGAAGCT
32LOC_Os02g15950vf0209042087穗型EP3; LPTGAGCATAAGAAGCTGAAAAGAAAGGAGCTGAGAGGGAAAGAGG
序号
Number		基因座位
Gene locus		InDel位点
InDel point		性状
Character		基因
Gene		上游引物
Upstream primer (5′-3′)		下游引物
Downstream primer (5′-3′)
33LOC_Os02g15950vf0209042088穗型EP3; LPTGAGCATAAGAAGCTGAAAAGAAAGGAGCTGAGAGGGAAAGAGG
34LOC_Os02g17380vf0209993979育性恢复基因Rf2; RfxCCACAGATCGGTGAAGGACTATGGGAGAGAGGAGGAAAGC
35LOC_Os02g36974vf0222330733株高GID2ACTGATGAAGTCCGAGCATCAACAGAACAAACTGGTAGGCCT
36LOC_Os02g39710vf0223985186抽穗期OsCOL4TTCTGAGGAAGGACGTACGCTTATTCATGTCACACGGGGC
37LOC_Os02g49230vf0230092882抽穗期DTH2GGCAAGCATGATCACTGGAGTGAGCTTCTCGCATGTTTGC
38LOC_Os02g49230vf0230093556抽穗期DTH2GTAAATCTAGCGCGAGGTCGGTCGCGGAGTCAGAGTCG
39LOC_Os02g50240vf0230668947株高、抽穗期、
子粒灌浆程度		OsGS1; GS1;OsGS1;1 ; OsGLN1;1 ; OsGS28TAACGCAAAAGCCACGGCCGGTACTTGTCCCATCCTGT
40LOC_Os02g50240vf0230669103株高、抽穗期、
子粒灌浆程度		OsGS1; GS1;OsGS1;1 ; OsGLN1;1 ; OsGS28TACACAAGAGCACCCAAACGTGGTTGCATGCTACCACTAC
41LOC_Os02g52710vf0232242495种子萌发RAmy1ACCAGTACAATCGAACCAAGCACCACGAAGTACTTCCTCCGT
42LOC_Os02g53690vf0232835334抽穗期OsGRF1; rhd1AAGAAGTGGCGGAGAGGTTTGCCGTACGCCATTGATCTTT
43LOC_Os02g56100vf0234327302叶色RNRL2AGCCATATAATTATATGAGCAAAATCCAAGACGATACTACCTCCATCCTAAAA
44LOC_Os03g02160vf0300718538抽穗期Ehd4GAAGCAACTGTCACCCATGGTACCTGCTCAACCAATCCCC
45LOC_Os03g07510vf0303822183粒型、千粒重PGL1TGAGAAGGAGAAGGAGCACGCCGTGAAATTCCGGTGGATT
46LOC_Os03g07530vf0303833269每穗粒数、子粒大小OsFBK12GGGGCAGAAGCATTAGAAGCCGAGAAAAATCCCCACCACC
47LOC_Os03g12660vf0306742028叶角度OsDWARF4; CYP90B2GAAGGTCATCAAGGACGTGCTAACACCGGCAGGATCTTCC
48LOC_Os03g13370vf0307210547株高、穗长、
子粒大小		OsAPC6CAACCGTGCATCCTACCAAGGGTGCAGAGGTAGCAGATGT
49LOC_Os03g22510vf0312928893株高OsSINCTAGTCCGGCCGTACATGAAAGTTTCTTGTGTGACGCGTG
50LOC_Os03g44500vf0325040498粒型qGL3TCAATTCGGAGCCAAACAAGAGGTGGCGAATGGAGTTTGAT
51LOC_Os03g57940vf0332993034抽穗期CKI; EL1; Hd16ATCGGGTGATGGAGATGCTCCTGAGGCATTCATCGCCATC
52LOC_Os04g46470vf0427385522株高OsCCD7; htd1; sd-t; dit1CCATGATCTTAACCCATTCGACATGGCTCGCATTAAGTGATGC
53LOC_Os04g52479vf0431018471叶型Nal1; qFLW4GTGTAGTTGGTGTTCCTCGCGAGAGTGCTGGGAATCTGGA
54LOC_Os04g52479vf0431018961叶型Nal1; qFLW4GGTGGAGGACAGGTGGTATCCAAACAACTCAGCCGCCAT
55LOC_Os04g52479vf0431019024叶型Nal1; qFLW4GGTGGTATCTTGTGCCGTCTAAACAAACAACTCAGCCGCC
56LOC_Os04g55560vf0432886736落粒性SHAT1ACTTGCATAGCCCAACAAGGGTCTTGGACTCTTGGCACTG
57LOC_Os05g05240vf0502572700粒型、千粒重OsPPKL2TGACGCTTCAGTGTTCAGTGGTGTAGATGAGAGGGACCGG
58LOC_Os05g06660vf0503443553千粒重、结实率、
粒型		GS5CATTGACGAGCTGAAGCACAGCGCAACAGTGAGCTATAGC
59LOC_Os05g09520vf0505366461粒型qSW5/ GW5GCCCGAACTACATGTCCAACCTCCACCACCACCACCTC
60LOC_Os05g50270vf0528755831叶型、茎秆节数NL1GATGCGGCTTCATCACCGCGGTGGGACGACGTTGAG
61LOC_Os06g03710vf0601465089株高DLT; OsGRAS-32;D62GTACAGCGGCTGGTCCAGCATGATCGCGAGGATGTTCG
62LOC_Os06g03710vf0601466875株高DLT; OsGRAS-32;D62GTGCCAAGAAGAGACCTCCTAGCCTTAGCCAGATACCACA
63LOC_Os06g03710vf0601467535株高DLT; OsGRAS-32;D62GGAGATGGAGATGCAGCCTATTCTTCCCTTCCCTTCCACC
64LOC_Os06g03710vf0601467561株高DLT; OsGRAS-32;D62TGTTGCCTCACCATTACCACTTCTTCCCTTCCCTTCCACC
65LOC_Os06g04200vf0601764669淀粉wx; qGC-6; Wx-mq; Wx-opCAAATAGCCACCCACACCACACAACAGAACAACACAAGCAGA
66LOC_Os06g04200vf0601764698淀粉wx; qGC-6; Wx-mq; Wx-opCACCCCCTCTCTCACCATTCACAACAGAACAACACAAGCAGA
67LOC_Os06g06050vf0602779752株型、株高D3TATCACTTCGCTGTGTGGCTCCATGGGCGACGTCTACTC
68LOC_Os06g06050vf0602779803株型、株高D3CACTCGCTTCACCCCAAATCCGTCAGGAAGCTCAGGATGT
69LOC_Os06g06050vf0602779807株型、株高D3CACTCGCTTCACCCCAAATCCGTCAGGAAGCTCAGGATGT
70LOC_Os06g06050vf0602779824株型、株高D3GAGTAGACGTCGCCCATGGCGTCAGGAAGCTCAGGATGT
71LOC_Os06g06050vf0602780108株型、株高D3CTGGAACACCTCGACCTCTCGATGAAGGCGTTCTGCTCG
72LOC_Os06g06560vf0603085679糊化温度OsSSI; SSS1GTCGCCATGATCCCCCCTCTCAGCCCACTCCTCTCTCT
73LOC_Os06g06560vf0603085750糊化温度OsSSI; SSS1AGAGAGAGGAGTGGGCTGAGAGCGAACCAGCTCATCCAC
74LOC_Os06g16370vf0609336003抽穗期Hd1GACGAGGAGGTGGACTCTTGACATGCCGTTGTTGCTGC
75LOC_Os06g16370vf0609336027抽穗期Hd1GACGAGGAGGTGGACTCTTGACATGCCGTTGTTGCTGC
76LOC_Os06g16370vf0609336033抽穗期Hd1GACGAGGAGGTGGACTCTTGGATGCGGTTGTCGTAGTACG
77LOC_Os06g40780vf0624311155株高OsPNH1GACATTCCATCCAAGGGTGCAGAGAGGGCAGTGAACACTC
78LOC_Os06g40780vf0624311160株型MOC1GACATTCCATCCAAGGGTGCAGAGAGGGCAGTGAACACTC
79LOC_Os06g44034vf0626555168株高、分蘖数sdt; OsmiR156hCCATTTGCTGCTGTTCCCTTTGCAGAGACTTGCAGCTAGT
80LOC_Os06g44100vf0626592286株高、分蘖数sdt; OsmiR156hGCTCGACGCAGAGAGACATGTTCACGACCACGCCGAC
81LOC_Os07g11020vf0706067072株高、分蘖数OsTRXh1GCATCCTGATGATTGTTCCCATCTTTCAGCACATGGTTGGC
82LOC_Os07g11020vf0706068130种皮、果皮红Rc; qSD7-1;qPC7AGGTGTCCATCATCGAGAGCGAGCTCCTGCATCGCCTG
83LOC_Os07g41200vf0724668239粒型GL7; GW7CTCACGCACATCCAACTGCCACATCTCATCTCACGCGTC
84LOC_Os07g41200vf0724668280粒型GL7; GW7GAAAGCCAAGGAGCAAGCAGCTCTCCCTCTCCTCACGACA
85LOC_Os07g41370vf0724787521穗型OsMADS18CCTCCCCCCATTTCCATCTTATCTTGTTCTCGATCCGCCG
86LOC_Os07g41370vf0724787522穗型OsMADS18CCTCCCCCCATTTCCATCTTATCTTGTTCTCGATCCGCCG
序号
Number		基因座位
Gene locus		InDel位点
InDel point		性状
Character		基因
Gene		上游引物
Upstream primer (5′-3′)		下游引物
Downstream primer (5′-3′)
87LOC_Os07g41370vf0724787544穗型OsMADS18CCTCCCCCCATTTCCATCTTAGAAGGTCACCTGCCTGTTT
88LOC_Os07g49460vf0729615794抽穗期DTH7; Ghd7.1; OsPRR37CCGCCCTCCCCAATATCTAGAAGTTACCTGCGGTTGGTTG
89LOC_Os07g49460vf0729626365抽穗期DTH7; Ghd7.1; OsPRR37CAAACTCAGATGCTGCACCAGCTGTGCAGGATGAAATGCT
90LOC_Os08g07740vf0804332913子粒产量、
株高和抽穗期		Ghd8GTCTAAACCATTGCACGCCATGATGGAGTTCGAGGGCATC
91LOC_Os08g07740vf0804332925子粒产量、
株高和抽穗期		Ghd8GTCTAAACCATTGCACGCCATGATGGAGTTCGAGGGCATC
92LOC_Os08g07740vf0804334115子粒产量、
株高和抽穗期		Ghd8ACCTATGCAAAGTGAGTAGAGATTATGCGCTGCACACATGTAAT
93LOC_Os08g07740vf0804334118子粒产量、
株高和抽穗期		Ghd8ACCTATGCAAAGTGAGTAGAGATTATGCGCTGCACACATGTAAT
94LOC_Os08g07740vf0804334120子粒产量、
株高和抽穗期		Ghd8ACCTATGCAAAGTGAGTAGAGATTATGCGCTGCACACATGTAAT
95LOC_Os08g07740vf0804334201子粒产量、
株高和抽穗期		Ghd8AACTTGGTTGTTTGCATTACATGTGTGATCATCACCTAAGATTTTTTAGTCTT
96LOC_Os08g08840vf0805138735淀粉合成OsGPTCTTGGGGCTCTCCTACGATCCCGCGGAAACAACAACAGAA
97LOC_Os08g30910vf0819086011抽穗期SDG710CAGGCCTCTGCATAGCTGATCTGAGCAATCGCAACCATGA
98LOC_Os08g31470vf0819461558株型PAY1CAGGTACCGTTCTCCCCGGCGAGCTTCTTGGATCTGTG
99LOC_Os08g31470vf0819461562株型PAY1CAGGTACCGTTCTCCCCGGCGAGCTTCTTGGATCTGTG
100LOC_Os08g31470vf0819461571株型PAY1CAGGTACCGTTCTCCCCGGCGAGCTTCTTGGATCTGTG
101LOC_Os08g31470vf0819462009株型PAY1GCTCTTCTCGTGCTTGGATGCCAGCCGAAGCAGAATCAAT
102LOC_Os08g41940vf0826498477千粒重qGW8; OsSPL16CACGGAATCGAGAGTGAGGACGGCATCTTGAGATCCCACT
103LOC_Os08g41940vf0826502759千粒重qGW8; OsSPL16AGCCACTTCTGAAGACGGTAGAGCACTTGTGTCAACCCAC
104LOC_Os09g02650vf0901157494茎秆强度、株高BC12GCATCAGTAGCAGTAGCAGCCGGAGCCAATAAGGAGGATTC
105LOC_Os09g02650vf0901157501茎秆强度、株高BC12GCATCAGTAGCAGTAGCAGCCGGAGCCAATAAGGAGGATTC
106LOC_Os09g27620vf0916785562不育tms9-1CCTGTGCTTCGCGATCAACGTGTAGCAGGTGGCCTCTG
107LOC_Os09g27620vf0916785573不育tms9-1CCTGTGCTTCGCGATCAACGTGTAGCAGGTGGCCTCTG
108LOC_Os09g35980vf0920731230分蘖角度TAC1CATCACTGGCGAGCGAATAGCCATGCATATCGTCGACAGC
109LOC_Os10g28330vf1014668336抽穗期Ehd2ACTGGTCATTGAGTTGCTGCGCACATTGACACCTGCAGAG
110LOC_Os10g28330vf1014668338抽穗期Ehd2ACTGGTCATTGAGTTGCTGCGCACATTGACACCTGCAGAG
111LOC_Os11g05850vf1102731154粒型、千粒重CycT1;3CCCACAAGTAGCTGCAGTTGTGCCATTGACCCAACCTAGT
112LOC_Os11g12740vf1107189229穗型SP1AACTACTACCTTTTGACTTGACCTTGGATGTATATGAGTCCCCACC
113LOC_Os11g12740vf1107189401穗型SP1ACATCCACCCTTACTAATATTTTTCCAGAGCAGCAGGAGGAGAAGG
114LOC_Os11g12740vf1107189651穗型SP1CGAGGAGCCAGTAGAAGAGGTTCTACCTCAGCTCCCTCCT
115LOC_Os11g12740vf1107189878穗型SP1GTGAACATCTCGGACACGCCCGTCACCTTCTCCATGGT
116LOC_Os11g12740vf1107190696穗型SP1TTTGTTGATGCGGTGGACAGGGCGGTAACCAAGAGGAAAC
117LOC_Os11g12740vf1107192768穗型SP1GCGTTGAAGTAGCTCGACAGCCTCAAGCCCAACATCATCG
118LOC_Os11g29840vf1116855382株型LA1AGCGGCCTTCTCACCATCGTCCTCGACGGTGAAGCC
119LOC_Os11g29840vf1116855390株型LA1AGCGGCCTTCTCACCATCGTCCTCGACGGTGAAGCC
120LOC_Os11g29840vf1116857535株型LA1CACAGGAAAGTCTACCCCGACCTCATGGGATGGTCCTTCC
121LOC_Os11g29840vf1116857536株型LA1CACAGGAAAGTCTACCCCGACCTCATGGGATGGTCCTTCC
122LOC_Os11g29840vf1116857537株型LA1CACAGGAAAGTCTACCCCGACCTCATGGGATGGTCCTTCC
123LOC_Os12g36030vf1222017077不育pms3; p/tms12-1; IncRNA; LDMGTTCATGTTGCTTCCTAACCGAAGGCTACGTACACTGCACAA
124LOC_Os12g36890vf1222573212叶型、穗型OsCD1GGTGAATATCGTCCCGGAGACCGAGTTCGTGCACTACAC

"↑" Indicate the difference locus, the same below

“↑”表示差异位点,下同

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2.2 InDel标记在杂交水稻种子纯度鉴定中的应用

选用SSR引物RM7120（来源于SN/T 3402-2012）,上游引物序列为5′-TGCCCAAAATATATGAAACC-3′,下游引物序列为5′-TTTTCTTGTTGAATGGGAAC-3′;选用InDel标记引物vf0121641804,上游引物序列为CATCACCTTCCCCCTCTCC,下游引物序列为TCCTTCCTTTCCTCGACCTG。先用SSR引物RM7120对样品两优688进行扩增,共扩增192个单株,检出9株生物学混杂,纯度为95.3%;再利用筛选出的InDel标记引物vf0121641804对上述品种相同单株进行PCR扩增分析,共扩增192个单株,检出11株生物学混杂（图1）,纯度为94.3%。根据标准SN/T 3402-2012结果判读总杂株数>4%视为纯度不达标,因此通过两种方法的检测均说明该品种种子纯度不达标,而且InDel标记检测出来的差异位点除了9个与SSR检测结果相同以外,还多检测出了2个差异位点,说明InDel可以用于品种的纯度检测。

图1

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图1   利用SSR标记RM7120和InDel标记vf0121641804检测水稻品种两优688的纯度

Fig.1   Detection of furification of Liangyou 688 rice variety by SSR marker RM7120 and InDel marker vf0121641804


2.3 功能性InDel标记在水稻品种真实性上的应用

首先用48对SSR引物进行扩增（来源于SN/T 3402-2012）,20粒水稻种子混样提取样品DNA,每个样品做2个平行,如图2中SSR所示,共4张图,每张图12个标记,每个标记4个单株,前2个单株为样品A,后2个单株为样品B。再利用筛选出的InDel标记中的24对引物,对上述样品进行单株扩增,每个标记4个单株,如图2中InDel所示,共4张图,每张图6个标记,每个标记8个单株,前4个单株为样品A,后4个单株为样品B。根据样品间电泳谱带的异同,判定受检品种的真实性。SSR标记检测结果显示,样品A与样品B间检出12个位点差异,品种间相似度为75%,品种间相似度<90%判定样品A与样品B为不同品种;InDel标记检测结果显示,样品A与样品B之间检出12个位点差异,品种间相似度为50%,品种间相似度<90%判定样品A与样品B为不同品种,InDel检测结果与SSR检测结果完全一致,说明水稻功能性InDel标记完全可用于水稻品种真实性鉴定。

图2

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图2   利用SSR标记和InDel标记检测水稻品种的真实性

Fig.2   Detection of authenticity of rice varieties by SSR and InDel markers


2.4 功能性InDel标记在水稻遗传多样性上的应用

全部124个InDel标记在245个品种间均检测到多态性,检测效率达100%。为明确245个水稻品种的遗传组成和遗传多态性,利用NTSYS对供试水稻品种进行聚类分析,结果（图3）表明,品种间遗传相似系数为0.53~0.95,遗传变异较小,表明供试水稻品种遗传相似性较高,遗传基础比较狭窄。以相似系数0.53为阈值,245个水稻品种分为2个类群（Ⅰ和Ⅱ）。类群Ⅰ包括215个品种,以杂交种为主;类群Ⅱ包括30个品种,以常规种为主。类群Ⅰ在遗传相似系数为0.64处可分为亚群ⅠA和ⅠB,亚群ⅠB包括6个品种,主要是两系杂交种,亚群ⅠA包含209个品种;类群Ⅱ在遗传相似系数为0.65处分为亚群ⅡA和ⅡB。亚群ⅡB只有1个品种两优036,亚群ⅡA包含29个品种。聚类分析可以将这245个品种按照遗传距离的远近分成不同类群,群体结构分析表明这245个品种存在明显的群体结构,能精确区分待测品种的基因型以及品种间的遗传差异。

图3

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图3   245个水稻品种聚类分析

Fig.3   UPGMA clustering analysis for 245 rice varieties


3 讨论

水稻是世界重要的粮食作物之一,同时也是基因组学研究的模式植物。选育优良品种是保证水稻增产的物质基础,因此品种保护权的维护很关键。随着分子标记的种类和数目的不断增加,分子标记的应用领域也在不断扩大[24,25]。目前分子标记技术除了用于水稻的基因定位以外,还广泛用在小麦[26]、玉米[27]、棉花[28]以及一些蔬菜花卉的基因定位,同时也用于这些作物的分子育种以及遗传关系分析。SSR标记的开发已经成熟,在分子生物学上的应用也比较多[29]。与SSR标记相比,InDel标记是基于基因测序基础上的新型标记[30,31],现代测序技术的发展以及基因组数据信息的公布为InDel标记的开发提供了很好的基础。从试验结果上来看,InDel标记的扩增效果要明显好于SSR标记,其稳定性高,扩增产物的带型简单,分离效果好,用到基因诊断和遗传分析上可以大大提高其分辨率、准确性和稳定性。由于我国是水稻种植大国,水稻品种繁多,混杂现象严重,因此,鉴别供试材料的纯度和真实性是育种单位面临的一个主要问题。通过室内试验的方法鉴别之后,有必要作进一步的田间表型鉴定,才能最终确定是否为同一品种。

基因型的改变导致了物种的遗传多样性,InDel是动植物以及微生物基因变异的重要来源,在基因变异中等位基因的变异大部分是由于InDel的插入或缺失造成的,很多逆转录因子的形成与InDel有关[32,33]。目前,大部分农作物的SSR指纹图谱已经构建,实现了分子标记的数字化,国外以及国内一些重点实验室使用毛细管电泳来构建指纹图谱,但是由于仪器设备和试剂耗材的昂贵也限制了其发展的范围。

本试验中用到的48对SSR核心引物,是参照标准GB/T20396-2006推荐的。所以用它来作为试验的对照具有可行性。试验结果表明,筛选出的InDel引物完全可以用在水稻品种纯度和真实性的鉴定上,而且其中24对核心InDel引物即可检测水稻品种的真实性,判断品种间的亲缘关系,比SSR的48对标准核心引物数量减少了一半,可以有效控制试验成本,操作上更加简便快捷,大大提高了效率。在水稻品种的纯度检测上由于扩增出来的单条带在判读杂交种上会有一些干扰,需要进一步改进优化。本试验收集的长江中下游的245个水稻品种之间的亲缘关系较近,遗传基础狭窄,原因可能是长期的人工选择和育种实践导致的,InDel可以有效检测不同品种间遗传变异,说明InDel检测方法可行,结果可靠。

4 结论

利用245个水稻品种,成功筛选出124个功能性InDel位点,利用这些位点不但可以有效地检测水稻品种纯度和真实性,还可以分析水稻品种的遗传多样性,为今后利用InDel标记及其他分子标记应用于水稻的种性鉴定提供了新的思路和方法。

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利用国内外的119份地方水稻品种资源材料通过InDel分子指数法分析水稻条纹叶枯病的抗性与籼粳分化的关系。在119份水稻品种中48份典型籼稻,其中47份抗水稻条纹叶枯病；7份籼稻和1份偏籼的水稻品种,也都抗条纹叶枯病；2份中间型的水稻品种，不抗条纹叶枯病；2份粳型的水稻品种，抗条纹叶枯病；59份典型粳稻品种，都不抗水稻条纹叶枯病。相关性分析表明籼型基因频率与水稻条纹叶枯病发病率呈极显著负相关。这些结果表明携带籼型基因频率越高的水稻材料，对水稻条纹叶枯病的抗性越强，而典型粳稻都表现为感病，推测水稻条纹枯病抗病基因可能起源于籼稻。

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中国作物分子育种现状与发展前景

作物学报, 2010,36(9):1425-1430.

DOI:10.3724/SP.J.1006.2010.01425      Magsci     [本文引用: 1]

近年来，随着基因组测序等多种技术实现突破，基因组学、表型组学等多门&ldquo;组学&rdquo;及生物信息学得到迅猛发展，作物育种理论和技术也发生了重大变革。以分子标记育种、转基因育种、分子设计育种为代表的现代作物分子育种技术逐渐成为了全世界作物育种的主流，在我国也正在成为作物遗传改良的重要手段。本文在界定分子育种的基础上，简要分析了中国作物分子育种研究现状和面临的问题，探讨了未来我国作物分子育种的发展策略。

McCouch S R, Chen X, Panaud O , et al.

Microsatellite marker development,mapping,and applications in rice genetics and breeding

Plant Molecular Biology, 1997,89(35):89-99.

[本文引用: 1]

郭奕生, 陆俊, 郭奕南 .

利用SSR分子标记鉴定水稻品种真实性

种子, 2014,33(6):115-118.

[本文引用: 1]

刘丹, 孙玉友, 魏才强 , 等.

InDel分子标记及其在水稻研究中的应用

种子, 2017,36(9):47-52,59.

[本文引用: 1]

初志战, 郭海滨, 曾栋昌 , 等.

籼粳稻基因组295个InDel标记的开发

作物学报, 2016,42(6):932-941.

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00932      Magsci     [本文引用: 1]

<p>插入/缺失(InDel)分子标记具有使用简单，结果清晰可靠的优点。本研究<span>通过比对粳稻品种日本晴和籼稻品种</span><span><span>93-11的基因组序列</span></span>，在全基因组范围内设计了634对InDel候选标记，通过PCR检测比较2种粳稻(日本晴和台中65)和2种籼稻(93-11和黄华占)的多态性，发现295对标记在2种籼稻间及2种粳稻间均带型一致，而在籼、粳亚种间有多态性，因此这套295对标记可以在涉及籼粳亚种的基因定位和分子育种中应用。</p>

王林友, 张礼霞, 勾晓霞 , 等.

利用InDel标记鉴定浙优系列杂交稻籼粳属性和预测杂种优势

中国农业科学, 2014,47(7):1243-1255.

DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2014.07.001      Magsci     [本文引用: 1]

【目的】准确鉴定水稻材料的籼粳属性及利用遗传距离预测杂种优势，为开展水稻超高产育种和籼粳亚种间杂种优势利用提供基础。【方法】利用19对籼粳稻特异插入/缺失（Insertion/Deletion，InDel）引物，对12个浙优系列杂交稻及其双亲的籼粳属性进行了InDel分子标记鉴定，根据被检测水稻样品在多个InDel 位点上的籼型或粳型基因频率，参考卢宝荣的方法，将供试样品分别判定为&ldquo;籼稻&rdquo;、&ldquo;偏籼&rdquo;、&ldquo;中间偏籼&rdquo;、&ldquo;中间偏粳&rdquo;、&ldquo;偏粳&rdquo;和&ldquo;粳稻&rdquo;。采用Nei的方法求算13个亲本间（1个不育系和12个恢复系）的InDel遗传距离，用UPGMA法进行遗传相似性聚类，用SPSS 17.0统计分析软件对InDel条带赋值进行主成分分析, 依据第一和第二主成分的特征向量的平均分量值作平面散点图。统计杂种F1稻谷产量、每穗总粒数、每穴有效穗、结实率、千粒重及单穗重各产量性状的对照优势，以此分析InDel遗传距离与杂种优势的相关性。【结果】（1）参试材料籼粳属性的判别：不育系浙04A被鉴定为&ldquo;粳稻&rdquo;，8个恢复系被判定为&ldquo;籼稻&rdquo;或&ldquo;偏籼&rdquo;，由其所配组的8个杂交组合被判定在&ldquo;中间偏籼&rdquo;到&ldquo;偏粳&rdquo;之间，证实了这8个组合为典型的籼粳交组合；另外4份恢复系被判定为&ldquo;偏粳&rdquo;，所配组的4个杂交组合被判定为&ldquo;粳稻&rdquo;。（2）参试材料的聚类分析：当GS 为0.350时，35份试验材料被分为&ldquo;粳稻&rdquo;和&ldquo;籼稻&rdquo;2个主群，GS为0.638时，粳稻主群又被划分为&ldquo;粳稻/偏粳&rdquo;和&ldquo;中间偏粳&rdquo;2个亚群。其中，粳稻/偏粳亚群包括不育系浙04A、4个粳粳交恢复系及粳粳交杂种F1、3个粳稻对照种和粳稻秀水09；中间偏粳亚群包括8个籼粳交杂种F1。籼稻主群则包括8个籼粳交组合的恢复系、3个籼稻对照种和籼杂组合汕优63。（3）InDel遗传距离与杂种优势的相关性：在以粳粳交、籼粳交组合整体作为分析对象时，InDel遗传距离与稻谷产量、每穗总粒数、单穗重呈极显著正相关，与结实率呈显著负相关；仅以籼粳交组合为研究对象时，InDel遗传距离仅与单穗重和千粒重呈显著正相关。【结论】供试的12个浙优系列中的8个组合被证实为典型的粳不/籼恢型籼粳交组合，这些组合的双亲间具有较远的遗传距离；InDel遗传距离在不同类型品种间具有较好的杂种优势预测能力，可用于单穗重的优势预测，即随着InDel遗传距离的扩大，杂种优势主要体现在单穗重的增加上。

赵小燕, 叶胜海, 李小华 , 等.

InDel标记鉴定水稻籼粳属性及预测杂种优势

浙江农业学报, 2015,27(8):1309-1316.

Magsci     [本文引用: 1]

利用21对特异插入/缺失（Insertion/Deletion，InDel）引物，对自主选育的浙粳4A与22个恢复系及其组合进行水稻籼粳属性分析。根据所配组合的产量性状表现，分析亲本的InDel遗传距离与杂种优势的相关性，探讨利用InDel标记遗传距离预测杂种优势的可行性。以供试材料在InDel位点上的多态性为原始数据，通过NTSYS聚类分析进行籼粳属性划分，结果与王明军等的方法所得结果基本一致。结果表明，InDel遗传距离与每穗总粒数、每穗实粒数、单株产量呈极显著正相关，相关系数分别为0627**，0602**和0712**；与单株有效穗数呈显著正相关，相关系数为0426*；与结实率、千粒重的相关性不显著，相关系数分别为0217和0004。表明InDel标记可用于水稻籼粳属性鉴定及杂种优势预测。

姚国新, 盛继群, 李长春 , 等.

利用InDel标记量化中国栽培水稻微核心种质的籼粳成分

湖北农业科学, 2014,53(16):3741-3745.

[本文引用: 1]

李亚莉, 马继武, 杨晓曦 , 等.

利用SSR分析滇型杂交稻亲本籼粳分化与杂种优势的关系

西南农业学报, 2012,25(2):347-353.

[本文引用: 1]

李欧静, 张桂华, 兰青阔 , 等.

基于SNP标记的种子纯度高效检测分析模型的建立

湖南农业科学, 2012(19):9-11,14.

[本文引用: 1]

闫双勇, 谭振波, 刘学军 , 等.

水稻抽穗期控制候选基因的SNP/InDel多态性分析

分子植物育种, 2005,3(3):335-341.

[本文引用: 1]

顾渝娟, 郭建英, 程红梅 .

单核苷酸多态性的检测及应用

中国农学通报, 2007,23(4):38-41.

Magsci     [本文引用: 1]

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）是近年来发展起来的一种高效便捷的分子标记。它是由单个碱基的转换、颠换、插入或缺失引起的点突变，使得群体之间和个体之间产生了差异。最初SNPs主要运用在与人体重要疾病的关联性研究中，随着检测技术不断提高以及多种生物SNP数据库的不断完善，单核苷酸多态性已经成为开展生物遗传进化及性状关联性分析等领域研究的重要工具。综合介绍了单核苷酸多态性的特点及主要检测方法，并简要概述了SNPs的应用领域和前景。

Lu B R, Cai X X, Jin X .

Efficient indica and japonica rice identification based on the InDel molecular method:Its implication in rice breeding and evolutionary research

Progress in Natural Science, 2009,19(10):1241-1252.

[本文引用: 1]

张丹丹, 周延清, 杨珂 .

基因特异性分子标记在植物育种中的研究进展

湖北农业科学, 2014,53(16):3741-3745.

[本文引用: 1]

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会. GB/T20396-2006,三系杂交水稻及亲本真实性和品种纯度鉴定DNA分析方法.

[本文引用: 1]

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.

SN/T 3402-2012,两系水稻品种真实性和纯度鉴定DNA分析法

[本文引用: 1]

Tung C W, Zhao K Y, Wright M H , et al.

Development of a research platform for dissecting phenotype-genotype associations in rice (Oryza SPP.)

Rice, 2010,3(4):205-217.

[本文引用: 1]

陈吉宝, 景蕊莲, 员海燕 , 等.

等位基因特异PCR技术的研究与应用

植物遗传资源学报, 2005,6(4):469-473.

[本文引用: 1]

蔡健 .

应用AFLP技术检测水稻遗传多样性的研究

中国农学通报, 2002,18(4):1-3,6.

[本文引用: 1]

杨旺兴, 许旭明, 祁建民 , 等.

应用表型系统聚类和SSR分子标记研究水稻亲本及籼粳衍生系遗传多样性

福建农业学报, 2013,28(3):211-216.

[本文引用: 1]

熊发前, 蒋菁, 钟瑞春 , 等.

分子标记技术的两种新分类思路及目标分子标记技术的提出

中国农学通报, 2010,26(10):60-64.

Magsci     [本文引用: 1]

<p>摘要：本文在分子标记技术的传统分类基础上，提出了分子标记技术的两种新分类思路，结合有关文献对第二种分类思路II所分的四大分子标记技术类型进行了各自的概念界定，并着重介绍了目标分子标记技术产生的理论与技术背景，最后列出了目标分子标记技术的代表种类及相关信息。</p>

Lee Y G, Jeong N, Kim J H , et al.

Development,validation and genetic analysis of a large soybean SNP genotyping array

The Plant Journal, 2015,15(4):625-636.

[本文引用: 1]

秦瑞英, 许学, 张立平 , 等.

小麦SSR指纹图谱及品种身份证的构建——基于毛细管电泳分析

中国农学通报, 2017,33(34):46-55.

[本文引用: 1]

赵文明, 王森, 陈艳萍 , 等.

基于60个核心SSR标记的糯玉米自交系遗传多样性分析

江西农业学报, 2018,30(12):1-8.

[本文引用: 1]

冯艳芳, 曲延英, 耿洪伟 , 等.

20份棉花品种DNA指纹图谱的构建

作物杂志, 2015(3):64-69.

[本文引用: 1]

Ramesh V K, Mauricio L R, David E , et al.

Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley,maize,rice,sorghum and wheat

Plant Molecular Biology, 2002,48(5-6):501-510.

[本文引用: 1]

姚国新, 黄文超 .

利用水稻籼粳分化InDel标记鉴定育种材料的籼粳属性

杂交水稻, 2013,28(3):53-57.

[本文引用: 1]

冯芳君, 罗利军, 李荧 , 等.

水稻InDel和SSR标记多态性的比较分析

分子植物育种, 2005,3(5):725-730.

[本文引用: 1]

杨洁, 赫佳, 王丹碧 , 等.

InDel标记的研究和应用进展

生物多样性, 2016,24(2):237-243.

DOI:10.17520/biods.2015205      Magsci     [本文引用: 1]

<p>InDel是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失(insertion-deletion), 是同源序列比对产生空位(gap)的现象。InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多。InDel多态性分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记, 其本质仍属于长度多态性标记, 可利用便捷的电泳平台进行分型。InDel标记准确性高、稳定性好, 避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。此外, InDel标记能扩增混合DNA样品和高度降解的微量DNA样品, 并进行有效分型。InDel标记目前已开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。随着位于功能基因上InDel标记的开发, 结合染色体步移和基因精细定位, 可将这些标记应用于相关物种经济性状的功能基因的筛选, 有利于优良基因的进一步开发和利用。</p>

孙惠敏, 夏米, 陈清玲 , 等.

基于InDel分子标记的20个水稻品种的籼粳属性分析

井冈山大学学报(自然科学版), 2016,37(6):100-106.

[本文引用: 1]

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