作物杂志,2021, 第1期: 38–46 doi: 10.16035/j.issn.1001-7283.2021.01.006

• 遗传育种·种质资源·生物技术 • 上一篇    下一篇

苦荞全基因组SSR位点特征分析与分子标记开发

马名川(), 刘龙龙, 刘璋, 周建萍, 南成虎, 张丽君()   

  1. 山西农业大学农业基因资源研究中心/农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室,030031,山西太原
  • 收稿日期:2020-04-08 修回日期:2021-01-06 出版日期:2021-02-15 发布日期:2021-02-23
  • 通讯作者: 张丽君
  • 作者简介:马名川,主要从事荞麦和燕麦种质资源创新与利用研究,E-mail: mamingchuan6@163.com
  • 基金资助:
    山西省农科院优秀青年基金项目(YCX2020YQ26);国家燕麦荞麦产业技术体系育种技术与方法岗位(CARS-07-A-2);山西省农科院杂粮分子育种平台专项(YGC2019FZ2);山西省农科院国家自然基金支持和培育项目(YGJPY2004)

Analysis of SSR Loci in Whole Genome and Development of Molecular Markers in Tartary Buckwheat

Ma Mingchuan(), Liu Longlong, Liu Zhang, Zhou Jianping, Nan Chenghu, Zhang Lijun()   

  1. Center for Agricultural Genetic Resources Research, Shanxi Agricultural University/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops, Taiyuan 030031, Shanxi, China
  • Received:2020-04-08 Revised:2021-01-06 Online:2021-02-15 Published:2021-02-23
  • Contact: Zhang Lijun

摘要:

目前苦荞SSR多态性标记数量较少,根据已发表的苦荞基因组测序数据,利用MISA软件对1~6核苷酸重复的SSR位点进行了查找和序列特征分析,批量设计引物并对引物进行了有效性和多态性检测。结果表明,苦荞基因组中共检测到1 640个SSR位点,其中三核苷酸重复型SSR最多,占比63.29%,五核苷酸重复型最少,仅占0.12%。AT/TA、AAG/CTT、ACC/GGT和ATC/GAT为出现频率较高的重复基序。苦荞基因组SSR序列长度变化范围为12~476bp,平均长度23.14bp,长度12~19bp的占比71.71%,长度≥20bp的占比28.29%。根据不同类型SSR位点设计并合成引物479对,选择200对引物对5份苦荞资源和3份甜荞资源进行多态性检测,有56对扩增出多态性条带,17对在苦荞种质中产生多态性条带,48对在甜荞种质中产生多态性条带,9对同时在两种种质中产生多态性条带。利用苦荞全基因组序列可实现SSR标记的批量开发,可鉴定出适用于苦荞和甜荞遗传多样性分析、遗传图谱构建和品种鉴定等研究的SSR引物。

关键词: 苦荞, 全基因组, SSR

Abstract:

The number of polymorphic SSR markers of tartary buckwheat is limited. In this study, SSRs with 1-6 nucleotide repeats were searched from the published whole genome sequences of tartary buckwheat using MISA software and the characterization of SSR sequences and their polymorphisms were analyzed. A total of 1640 SSR loci were detected in whole genome sequences of tartary buckwheat. The content of tri-nucleotide repeat SSRs was the highest, accounting for 63.29%; the content of penta-nucleotide repeat SSRs was the lowest, only 0.12%. The most abundant repeat motifs were AT/TA, AAG/CTT, ACC/GGT and ATC/GAT. The SSR length ranged from 12 to 476bp, with an average of 23.14bp. The ratio of SSR length ranged from 12 to 19bp was 71.71%, and the SSRs (≥20bp) was 28.29%. Based on the type of SSR loci, 479 pairs of primers were designed and synthesised. The 200 pairs of primers were selected for PCR amplification, 56 of them showed polymorphism, 17 pairs showed polymorphism in five accessions of tartary buckwheat, 48 pairs showed polymorphism in three accessions of common buckwheat, and nine pairs showed polymorphism in tartary buckwheat and common buckwheat. SSR markers can be developed in large-scale based on whole genome sequences of buckwheat and a large number of SSR primers also can be identified for genetic diversity analysis, genetic mapping and variety identification.

Key words: Tartary buckwheat, Whole genome, SSR

表1

供试材料信息

序号No. 资源编号Code 来源地Source 籽粒形状Seed shape 籽粒颜色Seed color 籽粒翅刺Prickly seed 花型Flower type
1 KQ1 山西 短锥 黑色 雌雄等长
2 KQ2 西藏 短锥 黑色 雌雄等长
3 KQ3 甘肃 长锥 灰色 雌雄等长
4 KQ4 青海 长锥 灰色 雌雄等长
5 KQ5 山西 短锥 深棕色 雌雄等长
6 TQ1 山西 三角形 黑色 雌雄异长
7 TQ2 贵州 三角形 黑色 雌雄等长
8 TQ3 内蒙古 三角形 褐色 雌雄异长

表2

苦荞全基因组SSR的重复类型、数量与分布频率

重复次数
Repeat number
重复类型 Repeat type 总计
Total
比例
Ratio (%)
单核苷酸
Mono-nucleotide
二核苷酸
Di-nucleotide
三核苷酸
Tri-nucleotide
四核苷酸
Quad-nucleotide
五核苷酸
Penta-nucleotide
六核苷酸
Hexa-nucleotide
4 0 0 0 0 1 48 49 2.99
5 0 0 667 23 1 13 704 42.93
6 0 106 236 13 0 5 360 21.95
7 0 44 80 13 0 1 138 8.41
8 0 54 21 4 0 1 80 4.88
9 0 26 13 6 0 0 45 2.74
10 0 16 5 6 0 0 27 1.65
11 0 12 1 1 0 0 14 0.85
12 18 10 6 2 0 0 36 2.20
13 10 9 3 1 0 1 24 1.46
14 7 5 1 2 0 0 15 0.91
15 1 4 0 2 0 0 7 0.43
16~25 13 29 5 4 0 0 51 3.11
≥26 5 85 0 0 0 0 90 5.49
总计Total 54 400 1 038 77 2 69 1 640
比例Ratio (%) 3.29 24.39 63.29 4.70 0.12 4.21

表3

苦荞全基因组SSR基序中不同重复基序出现的频率

重复类型
Repeat type
重复基序
Repeat motif
数目
Number
重复次数
Repeat number
平均长度
Mean length (bp)
比例
Ratio (%)
单核苷酸 A/T 43 12~92 18.74 2.62
Mono-nucleotide C/G 11 12~21 16.18 0.67
二核苷酸 AC/GT 37 6~238 36.27 2.26
Di-nucleotide AG/CT 52 6~12 13.38 3.48
AT/TA 310 6~133 38.67 18.90
三核苷酸 AAC/GTT 104 5~8 16.41 6.34
Tri-nucleotide AAG/CTT 277 5~22 17.48 16.89
AAT/ATT 19 5~16 19.42 1.16
ACC/GGT 199 5~13 21.72 12.13
ACG/CGT 16 5~8 16.5 0.98
ACT/AGT 22 5~9 17.45 1.34
AGC/CTG 80 5~10 16.20 4.88
AGG/CCT 120 5~11 16.25 7.32
ATC/GAT 172 5~14 16.97 10.49
CCG/CGG 29 5~7 16.14 1.77
四核苷酸 ACAT/ATGT 65 5~23 33.72 3.96
Quad-nucleotide AAAG/CTTT,AAAT/ATTT,ACCC/GGGT,
ACCT/AGGT,ACGT/ACGT,ATCC/GGAT
12 5~10 24.00 0.73
五核苷酸
Penta-nucleotide
ACAAA,TGGGC 2 4~5 22.50 0.12
六核苷酸
Hexa-nucleotide
AAAAAG/CTTTTT,AAACCC/GGGTTT,…,
AGGCGG/CCGCCT,CCCCGG/CCGGGG(共48种)
69 4~13 27.39 4.21

图1

苦荞基因组不同长度SSR的出现频率

图2

不同长度重复单元SSR序列长度变异情况

表4

56对SSR引物在8份荞麦材料中扩增产物的多态性分析

引物编号
Primer No.
引物序列(5′-3′)
Primer sequence
SSR基元
SSR motif
产物长度
Length of
product (bp)
多态性Polymorphism
5份苦荞
Five tarary buckwheats
3份甜荞
Three common buckwheats
P7 F:CAAGGTTCATGTAGTAACCGGAG
R: CTGCTTGGTTGATGTTGATGATA
(AAC)5 119
P13 F: GGATACCTTCATCTCTTTCGACC
R: TAGTTGTTATTGGAGAAGCAGGG
(AAC)5 111
P18 F: CTCAAATCCAGAACTCACTTGCT
R: GCCACGACGTCAATATACTCTTC
(GAT)6 156
P21 F: CATCACCACCAGTTCATAAGCC
R: TCCCTCCATTAAAGAACACCATA
(TGC)6 160
P27 F: ATAGACACATCTCTGACACCACG
R: ATCATCTTCTTCCATCTTGCTGA
(GAA)7 152
P29 F: CGGAAACAACAGCACAAGAGTAT
R: AGGCTATCGCTACTGCTGACTC
(TAG)6 83
P30 F: ACCAATCAACCATTTCTTACCCT
R: TAGCTTTGGAGACTTCATCTTCG
(ACA)7 143
P31 F: TACAATCTTCCTCCTCAAGGTCA
R: ATTGCTTGGGATTGTTGAAGTAG
(ACC)6 152
P34 F: TAGGAGGAAGACCGTTTATAGGC
R: TCATTCCAAAGACTGCTTGAATC
(CCA)9 156
P37 F: ATCCGAGGATCACAAAAATCATA
R: GGCAAAGAATCATTTAAAGCAAA
(GAT)5 135
P39 F: TACTGGACAGATCATTCAGCTTG
R: TGATGATTCTGATTCTGATGGTG
(TCACCC)4 138
P43 F: CACATAAGCTGAAGTCTACGCCT
R: GGTGTTAGGTCACCAGATGAAGA
(CCTCCA)5 136
P46 F: ACCAACTGCCAGAGACCATACTA
R: GGAGTATGTAAGCCGAATATCCC
(AAG)5 138
P54 F: TCATATTTGGAATTGTGGAGAGG
R: CCATTCATCAAAGGATGACCTAC
(TGG)5 126
P58 F: TCCTGCTGCTTCTTACCAAACTA
R: GCTTGCCCTACATGCATTAAGTA
(ACA)5 132
P59 F: ACTGTCAAATTTCAGGTCGAAAA
R: GTCTCCGGTTCTCTTTCCTAATC
(TCA)6 142
P62 F: GCTCCTCTAGCTCTTCTAGCGAT
R: TCAACGACTTCCACTTTCTCTTC
(AGA)5 151
P66 F: ATTACTAGTCTTCTTCGTCGCCC
R: ATGTTATTGTCGTCCAGAGAAGG
(CT)7 143
P67 F: GGTTGCATTGAAGTCTATTGAGG
R: TCAGATTCTTCTTCCAACACCTT
(AAG)6 159
P68 F: AAGAGCAAAAAGAAATTGCAAGA
R: AGCTGGTGTCATCAAGATCAGTT
(GAT)5 145
P75 F: CCGAATATCAACAATTTCTCTCG
R: GACGTTGAATATTGGAGTGAAGG
(TTC)5 137
P78 F: TCTTCAGCAACATCAAAGATCAA
R: ATCTTGCCCTTCAATATGGATTT
(ATC)5 123
P79 F: TTATAAGTCACCACCACCTCCAG
R: TGGGTACTCCCAGTCATAACATC
(CAC)7 154
P82 F: TTCAGATGGCACTAATGATGATG
R: GTTGCTTATGTTTCTTTGCATCC
(ATG)5 134
P86 F: AAGAAAAGGATTCATGGTTGGAT
R: GAGCATCAGCTATACGCCTCTTA
(GAA)6 159
P88 F: CTCTTCCTCTAGGATTTCTCGGA
R: AAGGATTTTCTTCGGTTGTTGAC
(ACC)6 93
P94 F: AGCTGAAGCAGTTTCTACACACC
R: AAGCCTCATTCTCATTCTCCTTC
(AATGAG)5 87
P105 F: ATTGGGTAAATGTGGTGTTGAAG
R: CTTGGGAGATTCCTTCTTGTTTT
(GAA)5 128
P108 F: ATCATTTTGTTGATAGCCCAGAT R: TACTGCAATGGTTGTGTTTGTGT (CAACAC)4 137
P110 F: CCACACCAAAGTATGAAATGGTT
R: GAAATGATCTCATGCACATACCA
(GAT)5 157
P114 F: GATGACGGAGAAGATATCAGCAG
R: TTCTTCATCATAAAAGAGGGCTG
(GCA)6 156
P116 F: AGCTACAACAAGGTGGTATCCAA
R: GAGAAGACTGCAACTGAGCTGAT
(CAA)5 108
P117 F: ATCTCAATCTTCTCTGCAGCAAC
R: TGGGATATTAGTTTGTTGAGCCA
(CAA)5 154
P118 F: ATCCTGGCATAAAAGATTGGATT
R: TCCTTTTCTGGCTTGATGTAAAC
(AT)6 83
P121 F: CTCATTCTCCTCTTTTGCCTCTT
R: GTCCTTAGAAGAGGACGTTCCAG
(GGA)5 156
P124 F: GTGAGGATTGGTCTGACATTGAT
R: GATCCCAGTTTCACACTATCACC
(GAT)7 151
P125 F: GACGAAATTGACCTTCTTCCAC
R: AGAAGTGGACGTTTCTTCATCAC
(AGG)5 141
P127 F: GCTCAAATCCACAAACAATTTTC
R: CAGTAACGAGGAACGGAGAATC
(GAG)6 138
P130 F: ACACCATCTCCTCCAACAGAAAC
R: CAAGCGTCTAGCTTTAAGGTGTC
(CCA)5 113
P135 F: ATGAAGGTAGAACGTGGTATGGA
R: GCTTCTTCAACAATGGAGTCAGT
(GAT)5 160
P143 F: TGCTTTGCTTGACTCTGATGATA
R: GTGAGCTTGTAACTTCCTCCTCA
(TGA)5 125
P144 F: GCTAAAGACAATCAAGAGACGGA
R: TAGGATTTCAACCCTCATCATGT
(AAC)5 133
P145 F: GGGCATAAGCGATCATACAATAG
R: TTGAGTTTCCTTCATGGTTCAAG
(ATG)5 89
P149 F: GTAGCTCTACAACAACAGGCACC
R: GCCATGGTGGTTACCAGAAGTAT
(CAA)5 152
P158 F: CAACAACTCATGTGATTGGAAAA
R: TTGATCCCTATAAGATCCTGCAA
(CAA)5 147
P159 F: TGGCAGTGAGTCACAGAGTAATG
R: CACGCAAGAATTTTTCAATAAGG
(GAT)7 148
P160 F: ATCATCCCCACTTGTCAACTCT
R: GTATCATCCTGGGACTGAGACTG
(TCTCAG)4 93
P162 F: GAAAAGGCAGCAGTAAATTCTGA
R: AAGCTATTGGATTTTCTACCCCA
(CAT)5 155
P163 F: TCTATACTTGGTGAGGAGTCGGA
R: GTCCCTTATAGCCATTTGCTCTT
(GAT)6 129
P171 F: GAGAGAAAGGGGAGAGGAAGAGT
R: CAAACATCTTGAACCTCCAAAAG
(AAG)5 103
P179 F: GATGTCTCGAATGATTGTGATGA
R: TGTCATCCTGAGTTTTCTTCGTT
(AAG)5 115
P183 F: TGTCCATATTAGACCCACCATTC
R: AGATGTTGCTTTGCTCTTTGAAC
(GAA)6 127
P192 F: AACCATCACTTCCTGAAAGAACA
R: CTGAGCCTCGAGATAGAATTTCA
(AGA)5 84
P198 F: ATCGGACTCTCCTAAGTCATCG
R: GTCATCATCGGTAGATGGACTGT
(CTC)5 145
P199 F: TGATCATGGATCTGGTTATTCAA
R: TAAACCCGATTTCCAAACTTCTC
(GAG)6 114
P200 F: TTATGGCTCTGAAAGAGAAGGAA
R: CTACGCAAACAAATGTCATTCAG
(GAA)5 139

图3

引物34和39在5份苦荞材料和3份甜荞材料中的多态性

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